Целенаправленная блокировка антител двойным функциональным конъюгированным антигенным пептидом и миметикой FC-III (DCAF)
Summary
Разработка двойного функционального конъюгированного антигенного пептида и миметики FC-III (DCAF) является новым для устранения вредных антител. Здесь мы описываем подробный протокол для синтеза молекулы DCAF1, который может избирательно блокировать антитела 4G2 для устранения эффекта повышения антител, зависящих от них во время инфицирования вирусом Денге.
Abstract
Устранение вредных антител из организмов является ценным подходом для вмешательства антител связанных заболеваний, таких как геморрагическая лихорадка денге и аутоиммунных заболеваний. Поскольку тысячи антител с различными эпитопами циркулируют в крови, ни один универсальный метод, за исключением двойного функционального конъюгирования антигенного пептида и миметики Fc-III (DCAF), не был направлен на конкретные вредные антитела. Развитие молекул DCAF вносит значительный вклад в прогресс целевой терапии, которые были продемонстрированы для устранения антител зависимых повышение (ADE) эффект в модели инфекции вируса Денге (ДЕНВ) и повысить ацетилхолин активности рецепторов в модели миастении gravis. Здесь мы описываем протокол для синтеза молекулы DCAF (DCAF1), который может избирательно блокировать антитела 4G2, чтобы замять эффект ADE во время инфекции вируса Денге, и проиллюстрировать связывание DCAF1 к 4G2 антитела анализа ELISA. В нашем методе DCAF1 синтезируется путем спряжения гидразина, производного пептида FC-III, и рекомбинантного, выраженного длинной селиксом с антигенной последовательностью через местную химическую перевязку (NCL). Этот протокол был успешно применен к DCAF1, а также другие молекулы DCAF для ориентации их cognate антител.
Introduction
Антитела играют важную роль в гуморальном иммунном ответе для нейтрализации патогенных бактерий и вирусов1. Тем не менее, некоторые антитела проявляют вредное воздействие на организмы, такие как кросс-реактивные антитела в эффекте ADE во время инфекции DENV и сверхреактивные антитела в миастении gravis, которая является аутоиммунным заболеванием2,3. ADE эффект опосредован кросс-реактивных антител, которые делают мост для подключения DENV и Fc рецепторов представления клеток4,5, в то время как миастения gravis вызвано чрезмерными антителами, которые атакуют рецепторы ацетилхолина между клеточными клетками соединений в мышечной ткани6,7. Хотя частично эффективные подходы были разработаны для лечения этих заболеваний8,9, несомненно, прямое устранение этих вредных антител будет делать прогресс для вмешательства.
Недавно молекулы DCAF, которые имеют двойные функциональные группы, были разработаны для целевых блокирующих антител10. DCAF является длинный пептид, который состоит из 3 частей: 1) антигенная часть, которая может конкретно распознать коньяк антитела, 2) Fc-III или Fc-III-4C тег для сильно связывания с fc региона антитела ингибировать либо FC рецептора или дополнения компонентов белков , 3) длинный суликовый связующий, который спряжяэтику этих двух функциональных групп10. Связующее звено, разработанное из домена Moesin FERM, было оптимизировано программным обеспечением “Россетей” для обеспечения того, чтобы антигенная часть и часть FC-III в молекуле DCAF могли связываться с регионами Fab и FC IgG одновременно. Четыре молекулы DCAF были синтезированы для целевой 4 различных антител, среди них DCAF1 был использован для устранения 4G2 антитела, которое является кросс-реактивного антитела во время инфекции DENV внести свой вклад в эффект ADE; и DACF4 был разработан для спасения рецепторов ацетилхолина, блокируя антитела mab35 в миастении gravis10.
В настоящем исследовании, принятом DCAF1 в качестве примера, мы показали протоколы для синтеза молекулы DCAF и обнаружения взаимодействия между DCAF и его коньяк антитела. DCAF1 полусинтезируется NCL подход11,12,13,14, который спряжядает гидразина производной от пептида Fc-III и выраженный связующий-антиген частей вместе. Подход NCL имеет значительные преимущества перед полностью химическим синтезом и полностью рекомбинантным выражением синтеза DCAF1, поскольку оба этих метода приводят к низкой урожайности и высокой стоимости. Нынешний подход является не только наиболее экономически эффективным способом получить полнометражный DCAF, но и может поддерживать конформацию связующих частей, аналогичных его родной форме. Поскольку различные молекулы DCAF имеют аналогичные последовательности, за исключением антигенных частей, наши методы синтеза DCAF1 и взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела могут быть применены к другим молекулам DCAF целевой блок их cognate антител, а также.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол здесь описывает полусинтез и обнаружение DCAF1 с помощью подхода NCL, который показан на рисунке 1. Короче говоря, два фрагмента DCAF1 являются химическими синтезированными и рекомбинантно выраженными, соответственно; Затем молекула DCAF1 по всей длине собирается, моди…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана Фондом Университета Цинхуа-Гейтс (нет. OPP1021992), Национальный фонд естественных наук Китая (No 21502103, 21877068 и 041301475), а также Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (No 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
