Bloqueio de anticorpos direcionados por um conjugado duplo-funcional de peptídeo antigênico e mimetismo FC-III (DCAF)
Summary
O desenvolvimento de um conjugado dual-functional do peptide antigénico e do mimetics FC-III (DCAF) é novo para a eliminação de anticorpos prejudiciais. Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para a síntese da molécula DCAF1, que pode seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para eliminar o efeito dependente do realce do anticorpo durante a infecção do vírus de dengue.
Abstract
A eliminação de anticorpos nocivos dos organismos é uma abordagem valiosa para a intervenção de doenças associadas a anticorpos, como a febre hemorrágica da dengue e doenças auto-imunes. Desde que os milhares de anticorpos com epítopos diferentes circulam no sangue, nenhum método universal, à exceção do conjugado duplo-funcional do peptide antigénico e dos mimetics FC-III (DCAF), foi relatado para alvejar anticorpos prejudiciais específicos. O desenvolvimento de moléculas de DCAF contribui significativamente para o avanço da terapia direcionada, que foram demonstrados para eliminar o efeito do realce dependente de anticorpos (ADE) em um modelo de infecção pelo vírus da dengue (DENV) e para impulsionar a acetilcolina atividade do receptor em um modelo do gravis da miastenia. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a síntese de uma molécula de DCAF (DCAF1), que possa seletivamente obstruir o anticorpo 4G2 para atenuar o efeito do ADE durante a infecção do vírus de dengue, e ilustrar a ligação de DCAF1 ao anticorpo 4G2 por um ensaio de ELISA. Em nosso método, DCAF1 é sintetizado pela conjugação de um derivado de hidrazina de um peptídeo FC-III e uma α-hélice longa expressa recombinante com seqüência antigênica através de ligadura química nativa (NCL). Este protocolo foi aplicado com sucesso a DCAF1 assim como outras moléculas de DCAF para alvejar seus anticorpos cognato.
Introduction
Os anticorpos desempenham papéis importantes na resposta imune humoral para a neutralização de bactérias patogênicas e vírus1. No entanto, alguns anticorpos exibem impactos nocivos para os organismos, tais como anticorpos Cross-Reactive no efeito Ade durante a infecção por DENV e anticorpos over-reativa em miastenia gravis, que é uma doença auto-imune2,3. O efeito Ade é mediado pelos anticorpos Cross-Reactive que fazem a ponte para conectar o receptor de DENV e de FC que apresenta pilhas4,5, quando os gravis da miastenia forem causados pelos anticorpos excessivos que atacam receptores da acetilcolina entre as junções célula-célula no tecido muscular6,7. Embora abordagens parcialmente eficazes tenham sido desenvolvidas para tratar essas doenças8,9, semdúvida, a eliminação direta desses anticorpos prejudiciais faria progressos para as intervenções.
Recentemente, as moléculas de DCAF, que têm grupos Dual-functional, foram desenvolvidas para o anticorpo alvejado que obstrui10. DCAF é um peptide longo que seja compor de 3 porções: 1) uma peça do antígeno que possa específico reconhecer o anticorpo cognato, 2) um tag de FC-III ou de FC-III-4C para fortemente ligar à região de FC do anticorpo para inibir o receptor de FC ou as proteínas do componente do complemento , 3) um longo vinculador α-helicoidal que conjuga esses dois grupos funcionais10. A parte do vinculador, projetada do domínio de Moesin FERM, foi aperfeiçoada pelo software de Rosseta para assegurar a parte do antígeno e a parte de FC-III em uma molécula de DCAF pode ligar às regiões de fab e de FC de IgG simultaneamente. Quatro moléculas de DCAF foram sintetizadas para alvejar 4 anticorpos diferentes, entre eles DCAF1 foi usado para eliminar o anticorpo 4G2, que é um anticorpo Cross-Reactive durante a infecção de DENV para contribuir ao efeito do ADE; e DACF4 foi projetado para o resgate de receptores de acetilcolina, bloqueando mab35 anticorpo em miastenia gravis10.
No presente estudo, DCAF1 como exemplo, foram mostrados os protocolos para a síntese da molécula de DCAF e a detecção da interação entre um DCAF e seu anticorpo cognato. O DCAF1 é semisintetizado pela aproximação de NCL11,12,13,14, que conjuga o derivado de hidrazina de um peptide de FC-III e as partes expressadas do linker-antígeno junto. A abordagem NCL tem vantagens significativas sobre a síntese totalmente química e expressão totalmente recombinante para a síntese de DCAF1, porque ambos os métodos levam a baixo rendimento e alto custo. A abordagem atual não é apenas a maneira mais rentável para obter o DCAF de comprimento total, mas também pode manter a conformação da parte do vinculador semelhante como sua forma nativa. Desde que as moléculas diferentes de DCAF têm seqüências similares à exceção das peças do antígeno, nossos métodos para a síntese DCAF1 e o ensaio da interação entre o anticorpo DCAF1 e 4G2 podem ser aplicados a outras moléculas de DCAF ao bloco alvejado seus anticorpos cognato também.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descreve a semisíntese e a detecção de DCAF1 usando a abordagem NCL, que é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os dois fragmentos de DCAF1 são químicos sintetizados e recombinantemente expressos, respectivamente; Então, a molécula cheia do comprimento DCAF1 é montada, modificada e purificada. Para a síntese de fragmento de FC-III derivado de hidrazina, usar resina de baixa capacidade de 2 CL é bastante importante, pois a alta capacidade tem um efeito negativo par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pela Universidade Tsinghua-Gates Foundation (não. OPP1021992), a Fundação Nacional da ciência natural de China (no. 21502103, 21877068 e 041301475), e o programa chave nacional da pesquisa e do desenvolvimento de China (no. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
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