Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)
Summary
Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l’eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l’anticorpo 4G2 per eliminare l’effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l’infezione da virus Dengue.
Abstract
L’eliminazione di anticorpi nocivi dagli organismi è un approccio prezioso per l’intervento di malattie associate agli anticorpi, come la febbre emorragica dengue e le malattie autoimmuni. Poiché migliaia di anticorpi con epitopi diversi circolano nel sangue, nessun metodo universale, ad eccezione del coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF), è stato segnalato per colpire specifici anticorpi nocivi. Lo sviluppo di molecole DCAF dà un contributo significativo al progresso della terapia mirata, che sono stati dimostrati per eliminare l’effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi (ADE) in un modello di infezione del virus Dengue (DENV) e per aumentare l’acetilcolina l’attività recettore in un modello di myasthenia gravis. Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di una molecola DCAF (DCAF1), che può bloccare selettivamente l’anticorpo 4G2 per attenuare l’effetto ADE durante l’infezione da virus Dengue e illustrare il legame dell’anticorpo DCAF1-4G2 da un saggio ELISA. Nel nostro metodo, la DCAF1 è sintetizzata dalla coniugazione di un derivato idrossizzante di un peptide Fc-III e un ricombinante espresso lungo elicoia con sequenza antigenica attraverso la legatura chimica nativa (NCL). Questo protocollo è stato applicato con successo a DCAF1 e ad altre molecole DCAF per colpire i loro anticorpi cognati.
Introduction
Gli anticorpi svolgono un ruolo importante nella risposta immunitaria umorale per la neutralizzazione di batteri e virus patogeni1. Tuttavia, alcuni anticorpi presentano impatti nocivi per gli organismi, come anticorpi cross-reattivi nell’effetto ADE durante l’infezione Da DENV e anticorpi sovrareattivi nella mioasthenia gravis, che è una malattia autoimmune2,3. L’effetto ADE è mediato dagli anticorpi cross-reattivi che rendono il ponte per collegare DENV e il recettore Fc presentando le cellule4,5, mentre la mioastenia gravis è causata dagli anticorpi eccessivi che attaccano i recettori dell’acetilcolina tra le giunzioni cellule-cellule nel tessuto muscolare6,7. Sebbene siano stati sviluppati approcci parzialmente efficaci per il trattamento di queste malattie8,9, senza dubbio l’eliminazione diretta di questi anticorpi nocivi farebbe progressi per gli interventi.
Recentemente, le molecole DCAF, che hanno gruppi dual-funzionali, sono state sviluppate per il blocco mirato degli anticorpi10. DCAF è un lungo peptide composto da 3 parti: 1) una parte dell’antigene in grado di riconoscere specifiche le sostanze anticorpi cognati, 2) un tag Fc-III o Fc-III-4C per legare fortemente alla regione Fc dell’anticorpo per inibire il recettore Fc o proteine componenti del complemento , 3) un lungo linker con elica a z che coniuga questi due gruppi funzionali10. La parte del linker, progettata dal dominio Moesin FERM, è stata ottimizzata dal software Rosseta per garantire che la parte antigene e la parte Fc-III in una molecola DCAF possano legarsi contemporaneamente alle regioni Fab e Fc di IgG. Quattro molecole DCAF sono state sintetizzate per colpire 4 diversi anticorpi, tra cui DCAF1 è stato utilizzato per eliminare l’anticorpo 4G2, che è un anticorpo cross-reattivo durante l’infezione da DENV per contribuire all’effetto ADE; e DACF4 è stato progettato per il salvataggio dei recettori dell’acetilcolina bloccando l’anticorpo mab35 in myasthenia gravis10.
Nel presente studio, preso DCAF1 come esempio, abbiamo mostrato i protocolli per la sintesi della molecola DCAF e la rilevazione dell’interazione tra una DCAF e il suo anticorpo cognato. La DCAF1 è semi-sintetizzata dall’approccio NCL11,12,13,14, che coniuga il derivato dell’iddrina di un peptide Fc-III e le parti linker-antigene espresse insieme. L’approccio NCL ha vantaggi significativi rispetto alla sintesi completamente chimica e all’espressione completamente ricombinante per la sintesi DCAF1, perché entrambi questi metodi portano a una bassa resa e ad un costo elevato. L’approccio attuale non è solo il modo più conveniente per ottenere l’intera lunghezza DCAF, ma può anche mantenere la conformazione della parte del linker simile alla sua forma nativa. Poiché diverse molecole DCAF hanno sequenze simili ad eccezione delle parti dell’antigene, i nostri metodi per la sintesi DCAF1 e l’analisi di interazione tra gli anticorpi DCAF1 e 4G2 possono essere applicati ad altre molecole DCAF per bloccare mirati anche i loro anticorpi cognati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descrive la semisintesi e il rilevamento di DCAF1 utilizzando l’approccio NCL, come illustrato nella Figura 1. In breve, i due frammenti di DCAF1 sono sintetizzati chimicamente e ricombinantemente espressi, rispettivamente; quindi, la molecola DCAF1 di intera lunghezza viene assemblata, modificata e purificata. Per la sintesi del frammento fc-III derivato da idzina, l’utilizzo di resina a 2 Cl a bassa capacità è molto importante, perché l’alta capacità ha un effetto neg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Tsinghua University-Gates Foundation (n. OPP1021992), la National Natural Science Foundation of China (n. 21502103, 21877068 e 041301475), e il National Key Research and Development Program of China (n. 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
