Küçük RNA-seq iyileştirilmesi: Daha Az Önyargı ve 2'-O-Metil RNA'ların Daha İyi Tespiti
Summary
Standart yöntemlere göre daha az önyargılı ve 2′-O-metil RNA’lar için artan hassasiyetiçeren ayrıntılı bir küçük RNA kütüphane telafi protokolü saiyoruz. Bu protokol maliyet tasarrufu veya kolaylık sağlamak için kitleri kullanarak ev yapımı reaktifler kullanılarak izlenebilir.
Abstract
Küçük RNA’ların (sRNA) yeni nesil sıralama (NGS) ile incelenmesi, kütüphane hazırlığı sırasında önyargı sorunlarıyla mücadele ediyor. Bitki mikroRNA’ları (miRNA’lar) gibi çeşitli sRNA tipleri 3’lük terminal nükleotitlerinde 2′-O-metil (2′-OMe) modifikasyonu taşırlar. Bu modifikasyon 3’ün adaptör ligasyonunu inhibe ederken başka bir zorluk daha ekler. Daha önce ‘TruSeq (TS)’ protokolünün değiştirilmiş sürümlerinin daha az önyargıya ve 2′-OMe RNA’ların daha iyi algılanmasına sahip olduğunu gösterdik. Burada ayrıntılı protokolü ‘TS5’ olan en iyi genel performansı gösterdi açıklar. TS5, ts kitinden ev yapımı reaktifler veya reaktifler kullanılarak eşit performansla takip edilebilir.
Introduction
Küçük RNA’lar (sRNA’lar) biyolojik süreçlerin çeşitliliğinin kontrolünde yer almaktadır1. Ökaryotik düzenleyici sRNA’lar genellikle 20 ile 30 nt arasındadır; üç ana tip mikroRNA (miRNA), piwi-etkileşimrra’lar (piRNA) ve küçük interferans RNA’ları (siRNA)dir. Anormal miRNA ekspresyon düzeyleri çeşitlihastalıklarakarışmış 2 . Bu, miRNA’ların sağlık ve hastalık taki önemini ve genel olarak SRNA’ları saptamak için doğru, nicel araştırma araçları nın gerekliliğini vurgulamaktadır.
Yeni nesil sıralama (NGS) sRNA’ları incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. NgS’nin kantitatif PCR veya mikrodizi teknikleri (qPCR) gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında başlıca avantajları, sRNA dizileri hakkında priori bilgisine ihtiyaç duymaması ve bu nedenle yeni RNA’ları keşfetmek için kullanılabilmesi ve buna ek olarak daha az arka plan sinyali ve doygunluk etkileri. Ayrıca, tek nükleotit farklılıkları algılayabilir ve mikrodizilerden daha yüksek bir iş elde eder. Ancak, NGS de bazı dezavantajları vardır; sıralama çalışmasının maliyeti nispeten yüksek kalır ve bir örneği sıralama için kitaplığa dönüştürmek için gereken çok aşamalı işlem önyargılara neden olabilir. Tipik bir sRNA kitaplık hazırlama işleminde, 3′ adaptör ilk olarak SNA ligase 2 (RNL2) ve atp yokluğunda preadentlated 3′ adaptör(Şekil 1)kesilmiş bir sürümü kullanılarak sRNA (genellikle toplam RNA’dan jel saflaştırılmış) ile bağlanır. Bu sRNA-adaptör ligasyonunun verimliliğini artırır ve sRNA daireselleştirme veya koncatemerization gibi yan reaksiyonların oluşumunu azaltır. Daha sonra, 5′ adaptör RNA ligase 1 (RNL1) ile, ardından ters transkripsiyon (RT) ve PCR amplifikasyonu ile bağlanır. Tüm bu adımlar önyargı3,4tanıtabilir. Sonuç olarak, okuma sayıları yapay, yönteme bağımlı ifade desenlerine yol açan gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtmayabilir. Belirli SRNA’lar bir kütüphanede aşırı veya az temsil edilebilir ve güçlü bir şekilde yeterince temsil edilmeyen sRNA’lar tespitten kurtulabilir. Durum özellikle bitki miRNA’ları, böcek ve bitkilerdeki siRNA’lar ve böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA’lar ile karmaşıktır ve 3′-O-metil (2′-OMe) modifikasyonu1. Bu modifikasyon kuvvetle inhibe 3 ‘ adaptör ligasyon5,RNA bu tür için kütüphane hazırlık zor bir görev yapma.
Önceki çalışma adaptör ligasyonu ciddi önyargı tanıttı gösterdi, RNA dizisi nedeniyle / yapı etkileri6,7,8,9,10,11. Ters transkripsiyon ve PCR gibi adaptör ligasyonunun aşağı doğru adımlarında önyargı6,11,12önemli ölçüde katkıda bulunmaz. Ligasyon yanlılığı, belirli bir diziye sahip adaptör moleküllerinin reaksiyon karışımındaki sRNA molekülleriyle etkileşime girebileceği gerçeğinden kaynaklanmaktadır ve bu da ligasyon için olumlu veya elverişsiz konfigürasyonlara yol açabilir (Şekil 2). Sorefan ve ark7’den elde edilen veriler RNL1’in tek bir mahsur bağlamı tercih ettiğini, RNL2’nin ise ligasyon için çift iplikçik tercih ettiğini göstermektedir. Bağdaştırıcı/sRNA eş kıvrım yapılarının belirli bağdaştırıcı ve sRNA dizileri tarafından belirlenmesi, belirli sRNA’nın neden belirli bir bağdaştırıcı kümesiyle neden aşırı veya az temsil edildiğini açıklar. Karşılaştırılacak bir dizi sRNA kitaplığı içinde aynı bağdaştırıcı dizilerinin kullanılması gerektiğini de unutmayın. Nitekim, daha önce farklı barkod dizileri giriş tarafından adaptörleri değişen kütüphaneler9,13sıralama miRNA profilleri değiştirir gözlenmiştir.
Bağdaştırıcı dizilerinin ligasyon kavşağına yakın randomize edilmesi bu önyargıları azaltır. Sorefan ve meslektaşları7 kendi ekstremitelerinde 4 rasgele nükleotit ile adaptörler ihdas, belirlenen “High Definition” (HD) adaptörleri, ve bu adaptörlerin kullanımı daha iyi gerçek sRNA ifade düzeylerini yansıtan kütüphanelere yol gösterdi. Daha yeni çalışmalar bu gözlemler doğruladı ve randomize bölge ligasyon kavşak11bitişik olması gerekmez ortaya . Adaptörler bu roman türü “MidRand” adaptörleri seçildi. Birlikte, bu sonuçlar gelişmiş bağdaştırıcı tasarımıönyargı azaltabilir göstermektedir.
Bağdaştırıcıları değiştirmek yerine, yanlılık reaksiyon koşullarının optimizasyonu yoluyla bastırılabilir. Polietilen glikol (PEG), ligasyon verimliliğini artırmak için bilinen bir makromoleküler kalabalık ajan14,belirgin önyargı azaltmak için gösterilmiştir15,16. Bu sonuçlara dayanarak, birkaç “düşük önyargı” kitleri piyasada ortaya çıktı. Bunlar arasında, klasik adaptörler veya HD adaptörlerle birlikte ligasyon reaksiyonlarında PEG kullanan kitler yer almaktadır. Diğer kitleri tamamen ligasyon önlemek ve 3′ poliadenilasyon ve şablon anahtarlama 3′ ve 5′ adaptör ek, sırasıyla12kullanın. Başka bir stratejide ise 3′ adaptör ligasyonu daireselleştirme adımı ile takip edilir,böylece 5′ adaptör ligasyonu 17.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00
Bir önceki çalışmada, biz önyargı mümkün olan en düşük düzeyde ve 2′-OMe RNA12en iyi tespiti ile bir sRNA kütüphane hazırlama protokolü aradı. Biz standart protokol (TS) daha 2′-OMe RNA daha iyi bir tespit vardı yukarıda belirtilen ‘düşük önyargı’ kitleri, bazı test etti. Şaşırtıcı ancak, modifikasyon üzerine (randomize adaptörlerin kullanımı, ligasyon reaksiyonlarında PEG ve saflaştırma tarafından aşırı 3′ adaptör kaldırılması) ikinci 2′-OMe RNA tespiti için diğer protokolleri geride. Burada, 2′-OMe RNA’ların en iyi genel tespitine sahip olan TS protokolü ‘TS5’e dayalı bir protokolü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Protokol, TS kitinden reaktifler ve ‘Nf’ kitinden bir reaktif kullanılarak veya paradan tasarruf etmek için ev yapımı reaktifler kullanılarak eşit performansla izlenebilir. Ayrıca sRNA’nın toplam RNA’dan arındırılması ve preadentlated 3′ adaptörünün hazırlanması için ayrıntılı bir protokol salıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Küçük RNA kitaplık hazırlığı, özellikle adaptör ligasyon adımları sırasında tanıtılan önyargı nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir. Bitki miRNA’ları, böceklerde, nematodlarda ve memelilerde piRNA ve böceklerde ve bitkilerde küçük müdahale eden RNA’lar (siRNA) gibi 3′ ucunda 2′-OMe modifikasyonu olan RNA’ların incelenmesi özellikle zordur çünkü 2′-OMe modifikasyonu 3′-ADAPTÖR ligasyonunu engeller. Literatürde sRNA kitaplık hazırlama protokollerini geliştirmek için bir dizi çözüm ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Bilimsel Araştırma Merkezi (CNRS), Fransız Alternatif Enerjiler ve Atom Enerjisi Komisyonu (CEA) ve Paris-Sud Üniversitesi tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma için tüm kütüphane hazırlama, Illumina dizilemesi ve biyoinformatik analizleri I2BC Yeni Nesil Sıralama (NGS) tesisinde yapılmıştır. I2BC NGS tesisinin üyeleri, makalenin eleştirel okunması ve yararlı öneriler için kabul edilmektedir.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
