Migliorare il piccolo RNA-seq: meno Bias e migliore rilevamento di 2'-O-Methyl RNA

I piccoli RNA (sRNA) sono coinvolti nel controllo di una diversità di processi biologici¹. Gli sRNA normativi eucarioti sono in genere di dimensioni comprese tra 20 e 30 nt; i tre tipi principali sono i microRNA (miRNA), gli RNA che interagiscono con il piwi (piRNA) e i piccoli RNA interferenti (siRNA). I livelli di espressione dell’aberrro miRNA sono stati implicati in una varietà di malattie². Ciò sottolinea l’importanza dei miRNA nella salute e nelle malattie e la necessità di strumenti di ricerca accurati e quantitativi per rilevare gli sRNA in generale.

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un metodo ampiamente utilizzato per studiare gli sRNA. I principali vantaggi di NGS rispetto ad altri approcci, come le tecniche quantitative PCR o microarray (qPCR), sono che non ha bisogno di una conoscenza a priori delle sequenze di sRNA e può quindi essere utilizzato per scoprire nuovi RNA, e in aggiunta soffre meno di effetti di segnale di fondo e saturazione. Inoltre, è in grado di rilevare differenze di singolo nucleotide e ha una velocità effettiva più elevata rispetto ai microarray. Tuttavia, NGS presenta anche alcuni inconvenienti; il costo di un’esecuzione della sequenza rimane relativamente elevato e il processo multifase necessario per convertire un campione in una libreria per la sequenza può introdurre distorsioni. In un tipico processo di preparazione della libreria sRNA, un adattatore da 3′ viene prima legato allo sRNA (spesso purificato in gel dall’RNA totale) utilizzando una versione troncata di RNA ligase 2 (RNL2) e un adattatore predeterminato 3′ (Figura 1) in assenza di ATP. Questo aumenta l’efficienza della legatura sRNA-adattatore e riduce la formazione di reazioni laterali come la circolarizzazione sRNA o la concatenazione. Successivamente, un adattatore da 5′ è legato da RNA ligase 1 (RNL1), seguito dalla trascrizione inversa (RT) e dall’amplificazione PCR. Tutti questi passaggi possono introdurre bias^3,4. Di conseguenza, i numeri letti potrebbero non riflettere i livelli effettivi di espressione sRNA che portano a modelli di espressione artificiali dipendenti dal metodo. Gli sRNA specifici possono essere sovrarappresentati o sottorappresentati in una libreria e gli sRNA fortemente sottorappresentati possono sfuggire al rilevamento. La situazione è particolarmente complicata con miRNA vegetali, siRNA in insetti e piante e piRNA in insetti, nematodi e mammiferi, in cui il nucleotide terminale 3 ha una modifica 2′-O-metila (2′-OMe)¹. Questa modifica inibisce fortemente la legatura dell’adattatore^5,rendendo la preparazione della libreria per questi tipi di RNA un compito difficile.

Il lavoro precedente ha dimostrato che la legatura dell’adattatore introduce gravi distorsioni, a causa degli effetti di sequenza/struttura dell’RNA^{6,7,8,9,10,11}. I passaggi a valle della legatura dell’adattatore, ad esempio la trascrizione inversa e la PCR, non contribuiscono in modo significativo alla^{distorsione 6,11,12}. La distorsione della legatura è probabilmente dovuta al fatto che le molecole dell’adattatore con una data sequenza interagiranno con le molecole di sRNA nella miscela di reazione per formare co-fold, che possono portare a configurazioni favorevoli o sfavorevoli per la legatura (Figura 2). I dati di Sorefan et al⁷ suggeriscono che RNL1 preferisce un singolo contesto spiaggiato, mentre RNL2 preferisce un doppio filo per la legatura. Il fatto che le strutture di co-piegadelle adattatore/sRNA siano determinate dall’adattatore specifico e dalle sequenze sRNA spiega perché specifici sRNA sono sovrarappresentati o sottorappresentati con un determinato set di adattatori. È anche importante notare che all’interno di una serie di librerie di sRNA da confrontare, devono essere utilizzate le stesse sequenze di adattatori. In fatti, è stato osservato in precedenza che la modifica degli adattatori con l’introduzione di diverse sequenze di codici a barre altera i profili miRNA nelle librerie di sequenziamento^9,13.

La randomizzazione delle sequenze dell’adattatore vicino alla giunzione di legatura probabilmente riduce queste distorsioni. Sorefan e colleghi⁷ hanno usato adattatori con 4 nucleotidi casuali alle loro estremità, designati adattatori “High Definition” (HD), e hanno dimostrato che l’uso di questi adattatori porta a librerie che riflettono meglio i livelli di espressione di sRNA reali. Un lavoro più recente ha confermato queste osservazioni e ha rivelato che la regione randomizzata non ha bisogno di essere adiacente alla giunzione di ligazione¹¹. Questo nuovo tipo di adattatori è stato chiamato “MidRand” adattatori. Insieme, questi risultati dimostrano che una migliore progettazione dell’adattatore può ridurre la distorsione.

Invece di modificare gli adattatori, la distorsione può essere soppressa attraverso l’ottimizzazione delle condizioni di reazione. Il glicole in polietilene (PEG), un agente di crowding macromolecolare noto per aumentare l’efficienza della legatura¹⁴, ha dimostrato di ridurre significativamente la distorsione^15,16. Sulla base di questi risultati, diversi kit “low bias” sono apparsi sul mercato. Questi includono kit che utilizzano PEG nelle reazioni di legatura, sia in combinazione con adattatori classici o adattatori HD. Altri kit evitano del tutto la legatura e utilizzano la poliadenilazione 3′ e la commutazione del modello per l’aggiunta dell’adattatore 3 e 5′, rispettivamente¹². In un’altra strategia, la legatura dell’adattatore 3′ è seguita da una fase di circolarizzazione, omettendo così la legatura dell’adattatore 5′¹⁷.

In uno studio precedente, abbiamo cercato un protocollo di preparazione della libreria sRNA con i più bassi livelli possibili di bias e la migliore rilevazione di 2′-OMe RNA¹². Abbiamo testato alcuni dei suddetti kit “low bias”, che avevano una migliore rilevazione di 2′-OMe RNA rispetto al protocollo standard (TS). Sorprendentemente, tuttavia, al momento della modifica (l’uso di adattatori randomizzati, PEG nelle reazioni di legatura e rimozione dell’adattatore in eccesso 3′ per purificazione) quest’ultimo ha sovraperformato gli altri protocolli per il rilevamento di 2’OMe RNA. Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo basato sul protocollo TS, ‘TS5′, che ha avuto il miglior rilevamento complessivo di 2’-OMe RNA. Il protocollo può essere seguito utilizzando reagenti del kit TS e un reagente dal kit ‘Nf’ o, per risparmiare denaro, utilizzando reagenti fatti in casa, con le stesse prestazioni. Forniamo anche un protocollo dettagliato per la purificazione dello sRNA dall’RNA totale e la preparazione di un adattatore pre-denunciato 3′.