Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Kleine Rna’s (Srna’s) zijn betrokken bij de beheersing van een diversiteit aan biologische processen¹. De eukaryotische regelgevende Srna’s zijn meestal tussen de 20 en 30 NT groot; de drie belangrijkste types zijn microRNAs (miRNA), piwi-interageren Rna’s (piRNA) en kleine storende Rna’s (siRNA). Afwijkende miRNA-uitdrukkings niveaus zijn betrokken bij een verscheidenheid aan ziekten². Dit onderstreept het belang van miRNAs in gezondheid en ziekte en de eis voor nauwkeurige, kwantitatieve onderzoeksinstrumenten om Srna’s in het algemeen te detecteren.

Next-generation sequencing (NGS) is een veelgebruikte methode om Srna’s te bestuderen. De belangrijkste voordelen van NGS in vergelijking met andere benaderingen, zoals kwantitatieve PCR-of Microarray technieken (qPCR), zijn dat het geen a priori kennis van de sRNA-sequenties nodig heeft en daarom kan worden gebruikt om nieuwe Rna’s te ontdekken, en bovendien lijdt het minder achtergrond signaal en verzadiging effecten. Verder kan het enkele nucleotide-verschillen detecteren en heeft het een hogere doorvoer dan micro arrays. Echter, NGS heeft ook een aantal nadelen; de kosten van een reeks sequentiëren blijven relatief hoog en het proces voor meerdere stappen dat nodig is om een steekproef in een bibliotheek voor sequentiëren te converteren, kan biases introduceren. In een typisch sRNA Library voorbereidingsproces, een 3 ‘ adapter wordt eerst geligeerd aan de sRNA (vaak gel-gezuiverd van totaal RNA) met behulp van een afgeknotte versie van RNA ligase 2 (RNL2) en een voorgeadenyleerd 3 ‘ adapter (Figuur 1) bij afwezigheid van ATP. Dit verhoogt de efficiëntie van sRNA-adapter ligatie en vermindert de vorming van nevenreacties zoals sRNA circularisatie of concatemerization. Vervolgens wordt een 5 ‘-adapter geligeerd door RNA ligase 1 (RNL1), gevolgd door omgekeerde transcriptie (RT) en PCR-versterking. Al deze stappen kunnen vooroordelen^3,4introduceren. Daarom lezen getallen mogelijk niet werkelijke sRNA expressieniveaus leidt tot kunstmatige, methode afhankelijke expressie patronen. Specifieke Srna’s kunnen ofwel over-of ondervertegenwoordigd zijn in een bibliotheek, en sterk ondervertegenwoordigd Srna’s kunnen ontsnappen aan detectie. De situatie is bijzonder gecompliceerd met plantaardige Mirna’s, Sirna’s in insecten en planten, en Pirna’s in insecten, nematoden en zoogdieren, waarbij de 3 ‘ terminale nucleotide een 2 ‘-O-methyl (2 ‘-OMe) modificatie¹heeft. Deze modificatie remt sterk 3 ‘ adapter ligatie⁵, waardoor bibliotheek voorbereiding voor dit soort RNA een moeilijke taak.

Vorige werk toonde aan dat de ligatie van de adapter ernstige bias introduceert, als gevolg van RNA-sequentie/structuur-effecten^{6,7,8,9,10,11}. Stappen stroomafwaarts van de ligatie van de adapter, zoals omgekeerde transcriptie en PCR, dragen niet significant bij aan bias^6,11,12. Ligatie bias is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat adapter moleculen met een bepaalde sequentie zullen interageren met sRNA moleculen in het reactiemengsel om co-plooien te vormen, die ofwel kunnen leiden tot gunstige of ongunstige configuraties voor ligatie (Figuur 2). Gegevens van Sorefan et al⁷ SUGGEREREN dat RNL1 de voorkeur geeft aan een enkele gestrande context, terwijl RNL2 een dubbele streng prefereert voor ligatie. Het feit dat de adapter/sRNA co-fold structuren worden bepaald door de specifieke adapter en sRNA sequenties verklaart waarom specifieke sRNA zijn over-of ondervertegenwoordigd met een bepaalde Adapterset. Het is ook belangrijk op te merken dat binnen een reeks sRNA-bibliotheken die moeten worden vergeleken, dezelfde adapter sequenties moeten worden gebruikt. Sterker nog, het is eerder waargenomen dat het veranderen van adapters door de invoering van verschillende barcode sequenties verandert Mirna profielen in sequencing bibliotheken^9,13.

Randomisatie van adapter sequenties in de buurt van het ligatie knooppunt vermindert waarschijnlijk deze biases. Sorefan en collega’s⁷ gebruikte adapters met 4 willekeurige nucleotiden aan hun extremiteiten, aangewezen “High Definition” (HD) adapters, en toonde aan dat het gebruik van deze adapters leiden tot bibliotheken die beter weerspiegelen echte Srna expressieniveaus. Meer recent werk bevestigde deze waarnemingen en bleek dat de gerandomiseerde regio niet hoeft te worden grenzend aan de ligatie junctie¹¹. Dit nieuwe type adapters kreeg de naam “MidRand” adapters. Samen tonen deze resultaten aan dat een verbeterd adapter ontwerp de bias kan verminderen.

In plaats van de adapters te wijzigen, kan bias worden onderdrukt door het optimaliseren van reactieomstandigheden. Polyethyleenglycol (PEG), een macromoleculaire verdringings middel waarvan bekend is dat het de ligatie-efficiëntie¹⁴verhoogt, is aangetoond dat het de bias^15,16significant vermindert. Op basis van deze resultaten verschenen er verschillende “low bias” kits op de markt. Deze omvatten kits die gebruik maken van PEG in de ligatie reacties, hetzij in combinatie met klassieke adapters of HD-adapters. Andere kits Vermijd ligatie helemaal, en gebruik 3 ‘ polyadenylering en sjabloon switching voor 3 ‘ en 5 ‘ adapter optellen, respectievelijk¹². In nog een andere strategie, 3 ‘ adapter ligatie wordt gevolgd door een circularisatie stap, dus weglaten 5 ‘ adapter ligatie¹⁷.

In een eerdere studie zochten we naar een sRNA Library Preparation protocol met de laagst mogelijke niveaus van bias en de beste detectie van 2 ‘-OMe RNAs¹². We testten enkele van de bovengenoemde ‘ low bias ‘ kits, die een betere detectie hadden van 2 ‘-OMe Rna’s dan het standaardprotocol (TS). Verrassend echter, bij modificatie (het gebruik van gerandomiseerde adapters, PEG in de ligatie reacties en verwijdering van overtollige 3 ‘ adapter door zuivering) de laatste presteerde beter dan de andere protocollen voor de detectie van 2 ‘-OMe Rna’s. Hier beschrijven we in detail een protocol op basis van het TS-protocol, ‘ TS5 ‘, dat de beste algemene detectie van 2 ‘-OMe Rna’s had. Het protocol kan worden gevolgd met behulp van reagentia uit de TS-Kit en één reagens uit de ‘ NF ‘ Kit of, om geld te besparen, met behulp van zelfgemaakte reagentia, met gelijke prestaties. We bieden ook een gedetailleerd protocol voor de zuivering van sRNA van totaal RNA en de bereiding van preadenylated 3 ‘-adapter.