تحسين الحمض النووي الريبي الصغيرة-seq: أقل التحيز والكشف أفضل من RNAs 2'-O-Methyl
Summary
نقدم بروتوكول تعويض مكتبة RNA صغيرة مفصلة مع تحيز أقل من الأساليب القياسية وزيادة الحساسية لRNAs 2′-O-methyl. ويمكن اتباع هذا البروتوكول باستخدام الكواشف محلية الصنع لتوفير التكلفة أو استخدام مجموعات للراحة.
Abstract
وتتحدى قضايا التحيز أثناء إعداد المكتبة دراسة التقارير RNSالصغيرة (sRNAs) من قبل الجيل التالي من التسلسل. عدة أنواع من الحمض النووي الريبي مثل microRNAs النباتية (miRNAs) تحمل تعديل 2′-O-ميثيل (2′-OMe) في النيوكليوتيد اتّحدى 3. يضيف هذا التعديل صعوبة أخرى لأنه يمنع ربط المحول 3′. لقد أثبتنا في السابق أن الإصدارات المعدلة من بروتوكول ‘TruSeq (TS)’ لها تحيز أقل وأحدث تية محسنة لـ RNAs 2′-OMe. هنا نقوم بوصف بالتفصيل بروتوكول ‘TS5’، الذي أظهر أفضل أداء عام. TS5 يمكن اتباعها إما باستخدام الكواشف محلية الصنع أو الكواشف من مجموعة TS، مع أداء متساو.
Introduction
وتشارك التقييمات RNSالصغيرة (sRNAs) في مراقبة تنوع العمليات البيولوجية1. عادة ما يتراوح حجم الـ sRNAs التنظيمية Eukaryotic بين 20 و30 nt؛ الأنواع الرئيسية الثلاثة هي microRNAs (ميرنا)، RNAs piwi التفاعل (بيرنا) وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA). وقد تورطت مستويات التعبير ميرنا Aberrant في مجموعة متنوعة من الأمراض2. وهذا يؤكد أهمية miRNAs في الصحة والمرض والحاجة إلى أدوات بحث دقيقة وكمية للكشف عن sRNAs بشكل عام.
الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لدراسة sRNAs. المزايا الرئيسية للـ NGS بالمقارنة مع النُهج الأخرى، مثل تقنيات PCR الكمية أو المصفوفة الدقيقة (qPCR)، هي أنها لا تحتاج إلى معرفة مسبقة بتسلسلات الحمض النووي الريبي، وبالتالي يمكن استخدامها لاكتشاف RNAs جديدة، وبالإضافة إلى ذلك فإنه يعاني من أقل من إشارة الخلفية وتأثيرات التشبع. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن الكشف عن الاختلافات النيوكليوتيد واحد ولها الإنتاجية أعلى من المصفوفات الدقيقة. ومع ذلك، فإن المنظمات غير الحكومية لديها أيضا بعض العيوب؛ تظل تكلفة تشغيل التسلسل مرتفعة نسبياً وقد تؤدي عملية الخطوات المتعددة المطلوبة لتحويل عينة إلى مكتبة للتسلسل إلى تحيزات. في عملية إعداد مكتبة sRNA نموذجية، يتم ربط محول 3 ‘ أولاً إلى sRNA (غالباً ما يتم تنقية هلام من إجمالي RNA) باستخدام نسخة مقتطعة من RNA ligase 2 (RNL2) ومحول preadenylated 3 ‘ (الشكل 1) في غياب ATP. وهذا يزيد من كفاءة الربط محول sRNA ويقلل من تشكيل ردود الفعل الجانبية مثل التعميم sRNA أو التعام. في وقت لاحق، يتم ربط محول 5 ‘بواسطة RNA ligase 1 (RNL1)، تليها النسخ العكسي (RT) وتضخيم PCR. كل هذه الخطوات قد إدخال التحيز3،4. وبالتالي، قد لا تعكس أرقام القراءة مستويات التعبير sRNA الفعلية مما يؤدي إلى أنماط التعبير الاصطناعية المعتمدة على الأسلوب. قد تكون sRNAs محددة إما ممثلة تمثيلاً زائداً أو ناقصاً في مكتبة، وقد تهرب sRNAs الممثلة تمثيلاً ناقصاً بشدة من الكشف. الوضع معقد بشكل خاص مع الميرنات النباتية، سيرنا في الحشرات والنباتات، وpiRNAs في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، والتي النيوكليوتيد الطرفية 3 لديها 2′-O-ميثيل (2′-OMe) تعديل1. هذا التعديل يمنع بشدة 3 ‘ربط محول5،مما يجعل إعداد المكتبة لهذه الأنواع من RNA مهمة صعبة.
العمل السابق أظهر أن ربط محول يدخل التحيز خطيرة،وذلك بسبب آثار تسلسل RNA / هيكل6،7،8،9،10،11. خطوات المصب من ربط محول مثل النسخ العكسي وPCRلا تسهم بشكل كبير في التحيز6،11،12. التحيز الربط من المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن جزيئات محول مع تسلسل معين سوف تتفاعل مع جزيئات sRNA في خليط التفاعل لتشكيل طيات مشتركة، التي قد تؤدي إما إلى تكوينات مواتية أو غير مواتية للربط(الشكل 2). وتشير البيانات الواردة من Sorefan وآخرون7 إلى أن RNL1 يفضل سياق واحد تقطعت بهم السبل، في حين أن RNL2 يفضل حبلا مزدوجة للربط. حقيقة أن يتم تحديد بنيات المحول/sRNA القابلة للطي بواسطة المحول المحدد وتسلسلات sRNA يفسر لماذا sRNA معينة هي الإفراط أو التمثيل الناقص مع مجموعة محول معينة. من المهم أيضاً ملاحظة أنه ضمن سلسلة من مكتبات sRNA لمقارنتها، يجب استخدام نفس تسلسلات المحول. في الواقع، وقد لوحظ سابقا أن تغيير المحولات عن طريق إدخال تسلسل الباركود مختلفة يغير ملامح ميرنا في تسلسل المكتبات9،13.
من المحتمل أن يؤدي عشوائية تسلسلات المحول بالقرب من تقاطع الربط إلى تقليل هذه التحيزات. Sorefan وزملاؤه7 تستخدم محولات مع 4 النيوكليوتيدات العشوائية في أطرافها، وعينت “عالية الوضوح” (HD) محولات، وأظهرت أن استخدام هذه المحولات يؤدي إلى المكتبات التي تعكس بشكل أفضل مستويات التعبير sRNA صحيح. وأكد عمل أحدث هذه الملاحظات وكشف أن المنطقة العشوائية لا تحتاج إلى أن تكون مجاورة لتقاطع الربط11. تم تسمية هذا النوع الجديد من المحولات محولات “MidRand”. معاً، توضح هذه النتائج أن تصميم المحول المحسّن يمكن أن يقلل من التحيز.
بدلاً من تعديل المحولات، يمكن منع التحيز من خلال تحسين ظروف رد الفعل. البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وهو عامل الازدحام الجزيئي الكلي المعروف لزيادة كفاءة الربط14، وقد ثبت للحد بشكل كبير من التحيز15،16. واستنادا إلى هذه النتائج، ظهرت عدة مجموعات “التحيز المنخفض” في السوق. وتشمل هذه المجموعات التي تستخدم PEG في ردود الفعل الربط، إما في تركيبة مع محولات الكلاسيكية أو محولات HD. مجموعات أخرى تجنب الربط تماما، واستخدام 3 ‘polyadenylation والتبديل قالب ل3 ‘و 5’ إضافة محول، على التوالي12. في استراتيجية أخرى، يتبع ربط محول 3 ‘خطوة التعميم، وبالتالي حذف 5 ‘ ربط محول17.
في دراسة سابقة، بحثنا عن بروتوكول إعداد مكتبة sRNA مع أدنى مستويات ممكنة من التحيز وأفضل الكشف عن 2′-OMe RNAs12. اختبرنا بعض مجموعات “التحيز المنخفض” المذكورة أعلاه، والتي كان الكشف عن هادىر 2′-OMe RNAs أفضل من البروتوكول القياسي (TS). ولكن من المستغرب، على تعديل (استخدام محولات معشاة، PEG في ردود الفعل الربط وإزالة محول الزائدة 3 ‘عن طريق تنقية) هذا الأخير تفوق البروتوكولات الأخرى للكشف عن RNAs 2’-OMe. هنا، ونحن نصف بالتفصيل بروتوكول يستند إلى بروتوكول TS، ‘TS5’، الذي كان أفضل الكشف العام من RNAs 2’-OMe. ويمكن اتباع البروتوكول باستخدام الكواشف من مجموعة TS وكاشف واحد من مجموعة ‘Nf’ أو، لتوفير المال، وذلك باستخدام الكواشف محلية الصنع، مع أداء متساو. كما نقدم بروتوكول مفصل لتنقية sRNA من الجيش الملكي النيبالي الكلي وإعداد محول 3 ‘preadenylated.
Protocol
Representative Results
Discussion
إعداد مكتبة RNA الصغيرة لا يزال تحديا بسبب التحيز، التي أدخلت أساسا خلال خطوات ربط محول. RNAs مع تعديل 2′-OMe في نهايتها 3 ‘مثل miRNAs النبات، piRNA في الحشرات، الديدان الخيطية والثدييات، وRNAs التدخل الصغيرة (siRNA) في الحشرات والنباتات من الصعب بشكل خاص لدراسة لأن تعديل 2′-OMe يمنع ربط محول 3’. وقد اقتُرح عدد ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المركز الوطني للبحوث العلمية، واللجنة الفرنسية للطاقات البديلة والطاقة الذرية، وجامعة باريس – سود. وقد أجريت جميع عمليات إعداد المكتبة وتسلسل إلومينا وتحليلات المعلوماتية الحيوية لهذه الدراسة في مرفق التسلسل من الجيل التالي من الـ I2BC. ويُعترف بأعضاء مرفق I2BC NGS للقراءة النقدية للمخطوطة والاقتراحات المفيدة.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Bioanalyzer Small RNA Kit | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Dark Reader transilluminator | various suppiers | ||
| HotStart PCR Kit, with dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex small RNA-seq V3 kit | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | optional |
| Novex TBE gels 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Urea gels 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Quantitation Starter Kit | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| RNase Inhibitor, Murine | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncated | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA ladder | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | optional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR small RNA ladder | Zymo Research | R1090 | |
| the last two numbers correspond to the set of indexes |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
- van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
- Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
- Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
- Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
- Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
- Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
- Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
- Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
- Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
- Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).
