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Developmental Biology

Disección, cultivo y análisis de células de cresta neural craneal primarias de ratón para el estudio de la delaminación y migración de células de cresta neuronal

Published: October 03, 2019
doi:
10.3791/60051
, , , , , , ,
1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology,King’s College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research,University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics,King’s College London, 4Department of Biological Applications and Technology,University of Ioannina

Summary

Este protocolo describe la disección y el cultivo de células de la cresta neural craneal a partir de modelos de ratón, principalmente para el estudio de la migración celular. Describimos las técnicas de imagen en vivo utilizadas y el análisis de la velocidad y los cambios en la forma celular.

Abstract

En las últimas décadas ha habido una mayor disponibilidad de modelos de ratón modificados genéticamente utilizados para imitar patologías humanas. Sin embargo, la capacidad de estudiar los movimientos celulares y la diferenciación in vivo sigue siendo muy difícil. Las neurocristopatías, o trastornos del linaje de la cresta neural, son particularmente difíciles de estudiar debido a la falta de accesibilidad de las etapas embrionarias clave y las dificultades para separar el mesenquima de la cresta neural del mesenquima mesodérmico adyacente. Aquí, nos propusimos establecer un protocolo rutinario bien definido para el cultivo de células principales de la cresta neural craneal. En nuestro enfoque diseccionamos el borde de la placa neural del ratón durante la etapa inicial de inducción de la cresta neural. La región fronteriza de la placa neural está explantada y cultivada. Las células de la cresta neural se forman en una hoja epitelial que rodea el borde de la placa neural, y a las 24 horas después de la explantación, comienzan a delaminar, sometiéndose a una transición epitelial-mesenquimal (EMT) para convertirse en células de la cresta neural completamente móvil. Debido a nuestro enfoque de cultivo bidimensional, las poblaciones de tejido distinto (placa neural versus cresta neural premigratoria y migratoria) se pueden distinguir fácilmente. Mediante enfoques de imágenes en vivo, podemos identificar cambios en la inducción de crestas neurales, EMT y comportamientos migratorios. La combinación de esta técnica con mutantes genéticos será un enfoque muy poderoso para entender la biología celular de la cresta neural normal y patológica.

Introduction

El linaje de la cresta neural (NC) es una población transitoria, multipotente y migratoria de células que aparece exclusivamente en vertebrados durante el desarrollo embrionario temprano1,2. Derivados de la cresta neural son extremadamente diversos, e incluyen glia, músculo liso, melanocitos, neuronas y hueso craneofacial y cartílago3,4. Debido a que la cresta neural contribuye a la función de muchos sistemas de órganos, este linaje es esencial para la embriogénesis humana. El desarrollo de LA NC aberrante está implicado en una amplia gama de defectos congénitos humanos más comunes (es decir, labio leporino y paladar hendido)5,y también en trastornos como la enfermedad de Hirschsprung (HSCR), el síndrome de Wardensburg (WS), el síndrome de CHARGE y el síndrome de Williams6 ,7,8,9.

El desarrollo de NC se ha explorado en una serie de sistemas de modelos no mamíferos, incluidos los modelos Xenopus,pollito y pez cebra. En los mamíferos, el trabajo en modelos de ratón ha identificado algunos de los eventos genéticos clave subyacentes al desarrollo de la cresta neural; sin embargo, ha sido más difícil seguir la biología celular de la migración de la cresta neural, debido a la inaccesibilidad del embrión de ratón (revisado en otros lugares10,11). Además, mientras que los estudios en polluelos, Xenopus y pez cebra han establecido una red reguladora de genes para NC, los estudios de pérdida de función en estos modelos animales a veces no presentan un fenotipo comparable en el ratón. Por ejemplo, en Xenopus, pez cebra y polluelo, la señalización wnt no canónica es uno de los mecanismos celulares que permite a la NC adquirir su capacidad migratoria12,13,14,15 . Sin embargo, en el ratón, la pérdida de señalización Wnt no canónica no parece afectar a la migración16. Dado que la migración in vivo de NC ha sido difícil de rastrear durante largos períodos en el ratón, no está claro si estas diferencias de especies reflejan diferentes modos de migración o diferencias en la regulación molecular.

Como se ha señalado, los estudios de NC en ratón han sido muy desafiantes porque el cultivo ex utero de embriones es laborioso. Además, la NC está constantemente en contacto íntimo con tejidos adyacentes como mesodermo y neurectodermo. El uso reciente de conductores Cre específicos de crestas neurales o colorantes exógenos nos ha permitido etiquetar fluorescentemente el NC migratorio; sin embargo, estos enfoques siguen siendo limitados. A pesar de múltiples informes que describen diferentes técnicas para visualizar la migración NC17,18, ha sido difícil resolver estas técnicas en un procedimiento simple y rutinario.

Está claro que hay una necesidad de técnicas que permitan el manejo y caracterización de los mamíferos NC. Centramos nuestros esfuerzos en el ratón nccraneal, ya que es el modelo principal para el estudio del desarrollo craneofacial humano y las neurocristopatologías. Refinamos nuestro enfoque basado en varios informes interesantes que describen el cultivo primario de células NC19,20,21. Aquí, describimos a fondo las técnicas de cultivo óptimas para explantar células NC primarias. Demostramos el método de imagen de células vivas y el uso óptimo de diferentes matrices para recubrir las placas de cultivo. Nuestro protocolo describe cómo capturar la migración de células NC vivas utilizando un microscopio invertido, que está diseñado como una guía para su uso con otros microscopios, así como un resumen detallado de nuestros análisis celulares.

El resultado esperado de la explanta debe ser una distribución bellamente dispuesta de las células que se distinguen claramente bajo el microscopio, donde se pueden ver tres poblaciones diferentes de células que representan (i) placa neural, (ii) premigratoria, y, (iii) células de la cresta neural migratoria. Demostramos cómo analizar los comportamientos celulares en el borde de la población premigratoria de células durante la transición epitelial-mesenquimal. También centramos nuestro esfuerzo en el estudio completo de las células migratorias para la velocidad celular, la distancia y la morfología celular.

Protocol

Todo el trabajo animal ha sido aprobado éticamente por el proceso de revisión ética del King’s College London y se realizó de acuerdo con la licencia de proyecto de la oficina del hogar del Reino Unido P8D5E2773 (KJL). 1. Preparación de reactivos Preparar soluciones y herramientas generales, incluyendo solución salina tampón de fosfato estéril (PBS), 70% etanol, herramientas de disección (fórceps y cuchillas de disección o agujas estériles), placas de plástico o portaobjetos de vidrio recubiertos con una matriz extracelular disponible comercialmente ( Hidrogel o fibronectina a base de ECM) (ver la Tabla de Materiales)y medios de cresta neural (ver más abajo). Preparar el medio basal de la cresta neural utilizando el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM, 4500 mg/L glucosa), 15% de suero bovino fetal (FBS), 0,1 mM de aminoácidos no esenciales esenciales mínimos (MEM NEAA 100X), piruvato sódico de 1 mM, 55 m de mercaptoetanol, 1000 mM de mercaptoetanol, 1000 mM de mineral medio esencial mínimo (MEM NEAA 100X), piruvato sódico de 1 mM, 55 m de mercaptoetanol, 1000 mM de mercaptoetanol, 1000 mM de mineral medio esencial mínimo (MEM NEAA 100X), piruvato sódico de 1 mM, 55 m de mercaptoetanol, 1000 mM de mercaptoetanol, 1000 mM de mercaptoetanol, 1000 mM de medio esencial mínimo (MEM NEAA 100X), piruvato sódico de 1 mM, 55 m de mercaptoetanol, 1000 mM de mercap penicilina de unidades/ml, 100 unidades/ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Acondicionar los medios durante la noche utilizando células alimentadoras STO inhibidas por el crecimiento21. Prepare las células STO (ver la Tabla de Materiales)medios para contener DMEM complementado por 10% FBS y 100 U/ml de penicilina, 100 U/ml de estreptomicina. Cultivar y ampliar las células STO para confluencia en 25 cm2 matraces recubiertos con 0.1% de gelatina. Aplicar 5000 rad de irradiación gamma. Semilla aproximadamente 3 x 106 células inhibidas en el crecimiento sobre un plato de 10 cm2 o 25 cm2 matraz (del paso 1.2.1.1). Añadir aproximadamente 10–12 ml de medio basal de cresta neural e incubar durante la noche.NOTA: Las celdas sembradas se pueden utilizar para producir un medio condicional durante un máximo de 10 días. Compruebe la aparición de las células con regularidad Filtrar el medio (0,22 m de tamaño de los poros) y complementar con 25 ng/ml de factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y 1000 U de factor inhibidor de la leucemia (LIF).NOTA: Almacenar a 4oC y utilizaren en un plazo de un mes o guárdelos a -20 oC y utilícelos en un plazo de 3 meses. Recubrir las superficies de cultivo de tejido con matriz extracelular.NOTA: Dependiendo de la pregunta biológica que se haga, la matriz se puede recubrir en platos de cultivo con fondo de vidrio, platos de cultivo de tejido plástico o resbalones de cubierta de vidrio. Consulte a continuación las diferentes diluciones de hidrogel a base de ECM que dependen del sustrato de la matriz. La fibronectina se ha probado en platos con fondo de vidrio y se ha resbaladizo sólo en las concentraciones especificadas a continuación. Aquí, nos referiremos a las superficies recubiertas de sustrato como “placas recubiertas”. Recubrir las superficies de cultivo de tejido con hidrogel a base de ECM.NOTA: Mantenga el sustrato frío hasta el enchapado, ya sea enfriando el medio o manteniéndolo en hielo. Descongelar el hidrogel a 4oC durante la noche. Añadir 5 ml de 10% FBS en DMEM a 5 ml de hidrogel para un volumen final de 10 ml (ver la Tabla de Materiales). Hacer 0.5–1 alícuotas de ml como conveniente y almacenar a -20 oC. Descongelar las alícuotas de hidrogel sobre hielo. Utilice una dilución 1:20 de la culata de hidrogel para recubrir el plástico. Utilice una dilución 1:5 de la culata de hidrogel para recubrir diapositivas de vidrio y placas de cultivo de tejido con fondo de vidrio.NOTA: Diluir el hidrogel en DMEM frío. Aplicar suficiente hidrogel diluido para cubrir el área deseada en placas/deslizamientos e incubar durante 30-45 min a 37oC. Utilice las placas/deslizamientos recubiertos inmediatamente o almacene los portaobjetos recubiertos a 4 oC durante la noche. Retire los excesos y enjuague los portaobjetos con DMEM de alta glucosa (opcional) antes de su uso. Recubrir las superficies del cultivo de tejido con fibronectina. Hacer alícuotas de 1 mg/ml de solución de fibronectina y almacenar a -80 oC. Diluir la fibronectina con PBS de Dulbecco (dPBS) a una concentración final de 1 g/ml. Aplicar suficiente fibronectina para cubrir el área deseada e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Retire la fibronectina residual y deje que el vidrio se seque durante 30-45 min. Enjuague los pozos o los resbalones de la cubierta con DMEM de alta glucosa (opcional) antes de su uso. 2. Día 1: Disección de embriones en etapa somita temprana NOTA: Utilice herramientas estériles y soluciones estériles. Si es necesario el genotipado, recoja el cuerpo del embrión para la extracción de ADN. La disección de la placa neural craneal se limita a los embriones a los 8,5 días después del coito (dpc). Seleccione embriones en la etapa de 5-8 somite. Diseccionar el útero en PBS y cortar el mesometrium para separar cada embrión(Figura 1A). La pared muscular del útero se contrae y el tejido decidual se hará visible(Figura 1B).NOTA: Mantener los embriones en el útero en PBS helada mientras que las disecciones se realizan un embrión a la vez. Mueva los embriones con una pipeta Pasteur de vidrio a PBS estéril fresco para mejorar la visibilidad y reducir la contaminación. Deslice los fórceps entre la capa muscular y el tejido decidual y retire la capa muscular con un segundo par de fórceps(Figura 1C). Usando fórceps, perfora el deciduum en los bordes del polo mesometrial y con un segundo par de fórceps rasgados para abrir perpendicularmente al polo. Pelar hacia atrás el tejido decidual con los fórceps para visualizar la membrana del Reichert. Retire la membrana de Reichert con cuidado. El saco de yema visceral se hace visible y el embrión se puede ver en el interior(Figura 1D). Retire el saco de yema visceral y el amnión(Figura 1E)y coloque el embrión para visualizar el pliegue de la cabeza(Figura 1F). Cortar el pliegue de la cabeza por encima del corazón y raspar el mesodermo subyacente usando fórceps y/o herramientas para las pestañas para obtener una placa neural limpia (NP) (Figura 1H).NOTA: El NP se puede mantener entero o dividirse por el eje anteroposterior para que cada lado se pueda chapar individualmente. El borde de la placa neural se puede recortar aún más lejos de la placa neural con el fin de minimizar las contribuciones neuronales a los explantas. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para transferir la placa neural diseccionada a un plato recubierto de hidrogel lleno de medios de cresta neural condicionados. Gire suavemente el plato para colocar el NP en el centro del pozo. Esto es importante para maximizar la calidad de fase para la creación de imágenes de células vivas (el día 2). Incubar durante la noche (o al punto de tiempo deseado) a 37 oC en 5% CO2. Las células de la cresta neural deben migrar visiblemente fuera de la placa neural.NOTA: Las células generalmente se unen dentro de 6–8 h. Después de que la explanta se adjunte, deje más tiempo para visualizar las celdas de migración. Por lo general, a las 24 h post explanta, podemos encontrar tres poblaciones distinguibles de células. La primera población, en el centro de la explantación, es la placa neural (NP). La segunda población, la NC premigratoria (pNC), rodea al NP en una hoja epitelial de células. La tercera población, en el anillo exterior, está formada por NC migratoria (mNC), que son más grandes en tamaño, y aparecen completamente mesenchymal(Figura 2). 3. Día 2: Imagen celular viva de las células de la cresta neural craneal murinos NOTA: Las imágenes deben realizarse a las 24 h después de la explantación para obtener una imagen y cuantificar de forma óptima la migración celular de la cresta neural. No es necesario actualizar los medios de inducción NC antes de las imágenes de células vivas. Se requiere acceso a un microscopio invertido, con una etapa motorizada y una cámara de ambiente incorporada. Utilice platos de cultivo de tejido multipozo adecuados para la tomade imágenes (Tabla de materiales). Configuración del microscopio Fije la cámara de ambiente a 37 oC y 5% de CO2. Perfore un agujero en la tapa de la tapa de la placa de cultivo de tejido para permitir que la aguja de CO2, conectada a la cámara de humidificación de CO2, se sitúe dentro de la placa. Coloque el plato de cultivo de tejido en el soporte de la muestra y pegue la tapa de la placa y la agujacosco 2 para evitar temblores durante la adquisición de varios pozos. Encienda el controlador del microscopio, el controlador de etapa y el software de imágenes. Concéntrese en las células NC craneales con un aumento de 10x (con anillo de fase coincidente en el condensador seleccionado). Ajuste el contraste de fase de alta calidad en el microscopio ajustando el diafragma del iris de campo, el diafragma del iris de apertura y el telescopio de centrado, como se especifica en el manual de configuración del microscopio. Imágenes de células vivas de contraste de fase Establezca el directorio o la ubicación del archivo donde se guardarán los archivos de lapso de tiempo. Establezca el tiempo de exposición, el binning y el área de la cámara. Establezca el número de puntos de tiempo, la duración de las imágenes y el intervalo de tiempo entre fotogramas. Para cuantificar la capacidad migratoria de células NC, ajuste el microscopio a un aumento de 10x, tomando 1 fotograma cada 5 min (217 puntos de tiempo durante 18 h). Para cuantificar la morfología celular, ajuste el aumento a 40x, tomando 1 fotograma/min (61 puntos de tiempo sobre 1 h). Para cuantificar la dinámica lamelipodial, ajuste el aumento a un aumento de 40x o 60x, tomando 1 fotograma cada 10 s (más de 10 min). Para imágenes de varios pozos, establezca la etapa mecánica para moverse entre las posiciones XY seleccionadas de interés. Confirme que las células NC craneales están enfocadas y las posiciones del escenario son correctas. Utilice el comando Adquirir para iniciar la creación de imágenes de lapso de tiempo. Una vez completadas las imágenes de lapso de tiempo, revise los datos multidimensionales y exporte los archivos .stk para su análisis.NOTA: .stk es un archivo de pila TIFF. Salga del software, apague el ordenador y apague los controladores de escenario, cámara y microscopio. 4. Análisis de imágenes: cuantificación de la migración de células de cresta neural NOTA: Para definir mejor los comportamientos celulares exhibidos por la migración de células de la cresta neural craneal murina, hemos analizado una serie de parámetros migratorios cuantificables, centrándose específicamente en la capacidad migratoria y la dinámica de la forma celular. (1) La migración (distancia acumulada) es la longitud total de la ruta tomada por la celda ( m); (2) La migración (distancia euclidiana) es la distancia en línea recta entre la posición inicial y la posición final de la celda (m); (3) La migración (velocidad de celda) es la distancia recorrida por celda por unidad de tiempo (m/min); (4) Forma de celda (área celular) es la superficie total cubierta por la celda. Establezca el píxel en la escala de micras según el microscopio de imagen. (A – Apx x Npx, donde Apx á área de píxel y Npx á número de píxeles. Unidades:2; (5) Forma de celda (circularidad celular) es la desviación de la forma de la celda de un círculo perfecto que se indica por un valor de circularidad de 1.0 (4o (A/P2)) donde A – área y P – perímetro. Seguimiento de una sola célulaNOTA: Para medir la migración de celdas NC, se generan coordenadas XY de celdas individuales en todos los fotogramas de lapso de tiempo. Esto permite el análisis posterior de las medidas de distancia, velocidad y persistencia de la migración celular. Abra ImageJ e importe datos como archivos de pila TIFF. Haga clic en Analizar (Analizar) Establezca Escala para calibrar los archivos .stk de acuerdo con la configuración del microscopio, trabajando en píxeles/m. Haga clic en Plugins (Plugins) Seguimiento de la página de seguimiento de la Seguimiento manual para abrir el plugin de seguimiento manual de celdas Image J. Para comenzar el seguimiento de celdas, seleccione Agregar pista. Realice un seguimiento de las celdas a través de todos los fotogramas de películas de lapso de tiempo, utilizando el núcleo como punto de referencia.NOTA: Se debe rastrear entre 10 y 20 celdas por explantación, con un total de 60 celdas rastreadas (n.o 3). Las células que se someten a división celular durante el transcurso del lapso de tiempo deben excluirse del análisis. Guarde y exporte los resultados como un archivo .csv. Los resultados representan el número de pista de celda individual, el número de sector y las coordenadas XY en todos los fotogramas. Cuantificación de la capacidad migratoria de la célula de la cresta neural Abra los datos de seguimiento de una sola celda (véase arriba). Convierta archivos .csv en formato de archivo .txt. Abra el software de migración (la Tabla de materiales). Haga clic en la pestaña Importar datos para importar los datos de seguimiento de celdas como un archivo .txt. En Conjuntos de datos de la página de datos de la empresa de Inicialización, seleccione el número de sectores o fotogramas que se analizarán y establezca la calibración XY y el intervalo de tiempo entre fotogramas. Seleccione Aplicar configuración para guardar la configuración. Seleccione el símbolo Trazar datos para formar trazados de trayectoria. Seleccione el símbolo Estadísticas para cuantificar las medidas de distancia y velocidad. Guarde los trazados de trayectoria como archivos de mapa de bits (.bmp) y las medidas de distancia y velocidad como archivos .txt. Seleccione el símbolo Eliminar datos. Repita el proceso para otros archivos de lapso de tiempo.NOTA: Las gráficas de trayectoria se pueden utilizar para visualizar la franqueza de las rutas de celda individuales para una condición o estado de celda determinado en el transcurso de películas de lapso de tiempo(Figura 4A). Los datos de distancia y velocidad almacenados en los archivos .txt se pueden utilizar para un análisis posterior. Cuantificación del área celular de la cresta neural y la circularidad Abra los archivos .stk de lapso de tiempo en ImageJ y calibrar de acuerdo con la configuración del microscopio, trabajando en píxeles / m. En Analizar ( Analizar) Establezca Medidas, haga clic para seleccionar los parámetros de forma de celda: área de celda, perímetro y descriptor de forma. Utilice la herramienta Selección a mano alzada para dibujar manualmente alrededor de cada celda, utilizando los límites de la membrana celular como guía. Presione ctrl + B teclas en el teclado para mantener el contorno de la celda sobrelainen en la imagen. Repita el proceso para las celdas en cada fotograma de lapso de tiempo. Usar la imagen ? Superposición ? A ROI Manager para almacenar los valores. Una vez que se hayan esbozado todas las celdas de interés por fotograma, haga clic en Medir. Guarde los resultados como un archivo .csv.NOTA: Se deben esbozar entre 10 y 20 celdas por película, con un total de 30–60 celdas analizadas por condición (n x 3). Los datos de forma celular (archivos .csv) se pueden utilizar para cuantificar cómo cambia la dinámica de la forma celular con el tiempo(Figura 4C)o cómo la morfología puede alterarse bajo diferentes tratamientos celulares.

Representative Results

Utilizando el procedimiento demostrado aquí, los embriones de ratón fueron diseccionados del útero, y se extrayieron los tejidos extraembrionarios(Figura 1A–D). Los embriones fueron escenificados en somitas (utilizando sólo embriones a 5-8 somites (ss), Figura 1E,F). La placa neural craneal fue diseccionada y el neuroepitelio fue aislado. Las células mesodermales, identificadas como células sueltas, circulares y mesenquimales, se cepillaron suavemente(Figura 1G-L). La placa neural anterior se puede explantar entera, en cuyo caso el tejido de la cresta neural emergerá lateralmente y se expandirá radialmente alrededor de la explantación, o cada borde de la placa neural (derecha e izquierda) se puede explantar por separado. Esto es particularmente útil cuando se explanta de mutantes genéticos. Dentro de las 24 h, una región de cresta neural craneal premigratoria (epitelial) se puede ver claramente alrededor de la explanta de la placa neural(Figura 2B). Además, una subpoblación de células de la cresta neural han sido sometidas a una transición epitelial a mesenquimal y aparecen completamente mesenquimales(Figura 2). Por lo tanto, tenemos varios anillos concéntricos de células distintas, con la placa neural (NP) en el centro, la cresta neural premigratoria (pNC) en el círculo intermedio, y una población de cresta neural migratoria (mNC) en el anillo exterior(Figura 2B). Para rastrear células NC, es posible utilizar modelos de ratón modificados genéticamente como mostramos en la Figura 2C. En este caso, hemos utilizado la cresta neural específica Wnt1::Cre; RosamTmG que da como resultado células NC etiquetadas en verde. En estos ratones, las células expresan el tomate de membrana (mT, en rojo) a menos que estén expresando Cre recombinase. La recombinación conduce a que las células expresen la proteína fluorescente verde de membrana (GFP, en verde). Los glóbulos rojos que se muestran en el centro de la explanta son células de la placa neural. Algunas células de la placa neural dorsal también expresan GFP; para la cultura a largo plazo, nos gustaría excitar todas las células en el centro. Para nuestros propósitos, la pureza de la explantación es suficiente para rastrear las diferentes poblaciones de células de cresta neural. Cuando se requiere una mayor pureza de la cresta neural, esta estrategia de etiquetado genético se puede combinar con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS) para garantizar la pureza de la población. Alternativamente, es posible fijar los explantes e identificar la población NC con etiquetado de anticuerpos. También era evidente en 24 h que los anillos concéntricos característicos de las células NC premigratorias y totalmente migratorias de los cultivos explantados no dependían ni se regían por la elección de la matriz(Figura 3). Cultivos explantados tanto en un hidrogel a base de ECM como en fibronectina formaron estructuras explantas comparables, que comprenden las tres poblaciones celulares, NP, pNC y mNC(Figura 3A,C). La morfología celular de la cresta neural también fue comparable entre las chapadas en el hidrogel basado en ECM y la fibronectina(Figura 3B,D). Sin embargo, explantes chapados en células producidas por fibronectina con lamellipodia más prominente en el borde delantero de la célula, aparentemente más polarizadas en la dirección de la migración(Figura 3B,D). Una vez que una población de células de la cresta neural migratoria es evidente, se pueden completar imágenes de células vivas. La microscopía de lapso de tiempo se establece en un aumento de 10x (18 h, 1 fotograma/5 min) para el análisis posterior de la migración de células NC(Figura 4A). El complemento ImageJ Manual Tracking genera coordenadas XY de celdas individuales en todos los fotogramas de las películas de lapso de tiempo(Figura 4B). Estas coordenadas se pueden procesar mediante el software de migración. Este software permite la visualización de pistas de células individuales a lo largo del tiempo (Figura 4B) y se puede utilizar para cuantificar la distancia acumulada y euclidiana, así como la velocidad de la célula. Los datos de imágenes de lapso de tiempo también proporcionan una gran cantidad de información sobre la morfología celular durante la migración de las células de la cresta neural craneal(Figura 4C). Al esbozar las membranas celulares individuales, el área celular y las mediciones perimetrales se pueden calcular a partir de todos los fotogramas de las películas(Figura 4C). Estas mediciones permiten la cuantificación posterior del área celular y la circularidad(Figura 4D). La Figura 4C muestra un análisis de los cambios de forma de celda a lo largo de 18 h. Tenga en cuenta que a medida que las células se alejan de la explantación, el área celular aumenta significativamente mientras que la circularidad celular permanece relativamente constante (ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey) ( Figura 4E,F). Esto sugiere que a medida que las células salen del borde epitelial y pierden contactos de células celulares, muestran un aumento del área de propagación celular. Las medidas de circularidad celular no cambiaron significativamente con el tiempo; sin embargo, se pueden ver cambios a corto plazo en la circularidad si se cuantifica un mayor número de puntos de tiempo. Las medidas de circularidad celular también pueden proporcionar datos interesantes sobre la dinámica de la forma celular en presencia de una señal quimiotáctica o en condiciones confinadas. Figura 1: Aislamiento de los explantes de cresta neural craneal de un e8.5 embrión.Las imágenes son imágenes fijas de un video que documenta la técnica de microdisección. (A–C) Disección del embrión del útero. (B–C) Usando dos fórceps afilados, desmonta suavemente la capa muscular. El panel (D) muestra el embrión dentro del saco de yema visceral (línea amarilla). Extraiga el embrión del saco de yema visceral. (E) Vistas laterales del embrión en la etapa 8.5 laterales. (F) Vista dorsal del embrión en la etapa 8.5. Contar somitas (ss) para determinar la edad de los embriones; generalmente 5–8 ss (círculos amarillos en F). (G) Mira de cerca la región craneal del embrión. Eliminar las membranas extraembrionarias de la región craneal; las somitas están marcadas con una línea amarilla. (H) Las disecciones de la placa neural anterior se realizan bajo el primer arco ramificado (línea amarilla). (I) Vista lateral de la disección de placaneural anterior. Los pliegues neuronales, donde surgen las células de la cresta neural, están marcados con una línea amarilla. (J–L) Retire el tejido mesodeérmico (células mesenquimales esponjosas) subyacentes a los pliegues neurales anteriores tanto como sea posible antes de enchapar NP en los platos de cultivo preparados. La película fue tomada usando un microscopio estéreo con una lente apocromática de campo ancho con zoom 3.0X (ver la Tabla de Materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Explantación de cresta neural craneal murino.(A) Representación esquemática de la vista dorsal de un e8.5 embrión de ratón. La región craneal del embrión se corta en la línea discontinua. El borde de la placa neural (resaltado en rojo) se aísla del tejido mesodermo circundante y se cultiva durante 24 horas para permitir que la cresta neural craneal emigre. Esquema adaptado de22,23. (B) Izquierda: Imagen representativa del campo brillante de una cresta neural craneal explanta 24 horas después del enchapado. Se observan tres poblaciones de células, que también se esquemas a la derecha. NP – placa neural, pNC – cresta neural premigratoria y mNC – cresta neural migratoria. Barra de escala a 250 m. (C) Imágenes de aumento más altas de un explant de ratón etiquetado genéticamente (Wnt1::cre; RosamTmG). Las células sin el conductor Cre expresan el tomate de membrana (mT) en rojo. La expresión de Cre bajo el control de un promotor Wnt1 específico de la cresta neural conduce a la escisión del casete mT y la expresión de la membrana GFP (mG) en verde. Los núcleos están manchados con Hoescht (en azul). Barra de escala a 200 m. (D–D”) Imágenes de aumento más altas de células migratorias que expresan la membrana GFP (D). (D’) El ADN está etiquetado con Hoescht (azul). (D”) Combinación de D y D’. Barra de escala a 20 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Explantes cultivados en diferentes sustratos.(A–B) Imágenes de contraste de fase de explantes cultivados en ECM-hidrogel comercial. (C–D) Explantas cultivadas en fibronectina de 1 g/ml. Las células de la cresta neural de la placa neural (NP), premigratoria (pNC) y migratoria (mNC) se pueden distinguir por sus diferentes morfologías celulares. Barra de escala a 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Cuantificación de la migración de célulasde cresta neural craneal y dinámica de la forma celular.(A) Los marcos de contraste de fase de las imágenes de lapso de tiempo de los cultivos explantados superpuestos con pistas de células de cresta neural única, utilizando el plug-in ImageJ/Fiji Manual Cell Tracking. Diez células mNC representativas se rastrearon manualmente a lo largo de 18 h (217 fotogramas) y el XY coordenadas se exportaron. Los datos se representan como trazados de puntos y líneas de superposición. Las células se enchaparon en fibronectina de 1 g/ml. Barra de escala a 200 m. (B) Gráfica de trayectoria representativa de celdas de 10 mNC, generadas mediante software de migración. (C) Marcos de contraste de fase tomados del análisis de lapso de tiempo de cultivos explantados. Las líneas discontinuas describen 8 células representativas de la cresta neural migratoria analizadas para la dinámica de la forma celular cuando se platean en fibronectina de 1 g/ml. Barra de escala a 200 m. (D) Representación esquemática de los cálculos utilizados para cuantificar el área celular y la circularidad. La morfología celular del esquema es la de la celda resaltada en azul (C). Un área depíxeles de px, Npx á número de píxel, A, área, P, perímetro (1 píxel á 1.60772 m2). (E–F) La cuantificación del área celular y las medidas de circularidad celular a lo largo del tiempo. Los datos representan la media de SEM. Cada punto representa una celda (n a 60), tomada de 3 experimentos independientes, y analizado a 0 h, 6 h, 12 h y 18 h (ns no significativo, * p<0.05, **** p < 0.0001 ANOVA unidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El estudio de las células de la cresta neural de los mamíferos ha sido un desafío para los científicos debido a la naturaleza utero del desarrollo de los mamíferos. Los estudios in vivo son difíciles de configurar, ya que el embrión debe ser manipulado en condiciones que imitan la vida en el útero. En la práctica, es casi imposible cultivar reproduciblemente estos embriones (E8+) durante más de 24 horas, especialmente para imágenes en vivo. Además, la inducción y migración de la cresta neural se producen simultáneamente con el cierre del tubo neural y el giro embrionario en el ratón; este es un evento morfogenético crucial y estresante, que con frecuencia falla cuando los embriones se cultivan ex utero. Por lo tanto, la tasa de éxito de los enfoques ex utero es generalmente baja. El uso de células NC inmortalizadas21 es una herramienta útil para reducir el uso animal y puede proporcionar una mejor fuente de células de cresta neural para análisis a largo plazo, transfección y estudios de enriquecimiento. Sin embargo, es evidente que es necesario cultivar de forma fiable las células de la cresta neural primaria. Nuestro método es aplicable a los modelos genéticos condicionales o noqueados de ratón. Un método comparable al nuestro ha sido descrito para otras poblaciones de crestas neurales20; sin embargo, nuestro método describe a fondo el aislamiento paso a paso de las células NC craneales murinas. También describimos en detalle el uso de diferentes matrices, así como el procedimiento de análisis de migración.

Para lograr resultados consistentes, encontramos que se prestó especial atención a la puesta en escena durante la selección de embriones. No es sorprendente que el número de somitas se correlaciona con diferentes etapas en el desarrollo de NC craneal. Por lo tanto, el conocimiento de la anatomía embrionaria es muy importante antes de adquirir cualquier dato experimental. Este enfoque se puede adaptar a aislar poblaciones discretas de células de cresta neural, dependiendo de la pregunta biológica y las células diana.

Una vez seleccionados y diseccionados los embriones, las células mesodérmicas se pueden distinguir fácilmente y deben eliminarse para permitir una mejor visualización y reducir la contaminación. Para cultivos a largo plazo, el tejido de la placa neural se puede extraer a 24 h de chapado con el fin de evitar la contaminación por los tejidos neurales. Un refinamiento adicional podría ser el uso de etiquetado de linaje fluorescente (por ejemplo, utilizando un Wnt1::cre o Sox10::creERT controladores combinados con reporteros fluorescentes24,25) para distinguir las células de la cresta neural de otros tejidos como se muestra en la Figura 2C.

Informes anteriores han puesto de relieve el potencial de los cultivos explantadores NC de ratón en diferentes matrices, más comúnmente en hidrogeles ECM comerciales, fibronectina y colágeno I20,21,26. En nuestras manos, los cultivos explantados de NC craneales de ratón se cultivan con éxito en las tres matrices, a concentraciones especificadas en los informes originales (datos no mostrados). El enfoque inicial refinado que adaptamos para nuestros cultivos explantados NC utilizó un hidrogel comercial como matriz de elección, que consistía principalmente en laminina y colágenos21(Figura 3A-B). Sin embargo, la composición de este hidrogel no está claramente definida, con factor de crecimiento desconocido y contenido de proteínas. Como tal, desde entonces hemos cambiado nuestro enfoque para enchapar cultivos de explantación NC de ratón en fibronectina (Figura 3C–D). La fibronectina está bien definida y muy expresada en las membranas ECM y sótano a lo largo de las cuales las células NC migranin vivo28,29,30. Para optimizar una matriz de fibronectina que mejor replique la migración y morfología de las células de la cresta neural como se ve utilizando el hidrogel, comparamos los comportamientos celulares NC exhibidos en el hidrogel con una valoración de 0,25–30 g/ml de fibronectina, y definimos 1 g/ml de fibronectina como proporcionar propiedades ideales (datos no mostrados). Creemos que este trabajo preliminar puede ayudar a establecer un marco para la comparación sistemática de matrices, como la fibronectina, con las descritas anteriormente, a saber, el colágeno y la minin32,33,34. Sería especialmente interesante comparar la capacidad migratoria de células NC de ratón en fibronectina frente a colágeno I, dado que el colágeno-IA1 es secretado endógenamente por células NC de ratón, aviares y humanas28,30,31,32. Por lo tanto, el colágeno I es tan relevante como la fibronectina en la consideración de la elección de la matriz. También vale la pena reconocer que la biodisponibilidad de los factores de crecimiento en los medios de comunicación puede ser alterada por diferentes componentes de la matriz, especialmente dado el alto contenido sérico de nuestros medios. Para superar esto, actualmente estamos trabajando para producir condiciones de cultivo definidas sin suero. Estos medios definidos se utilizan con éxito en los protocolos de inducción de cresta neural en el campo de células madre pluripotentes, pero requieren una mayor optimización para nuestro sistema de cultivo explant NC33,34. Nuestro trabajo también puede servir como punto de partida para condiciones de refinación para otros tipos de células NC como NC cardiacas y troncales, y para estudios posteriores de diferenciación NC. Lo más importante es que este protocolo permite el aislamiento de células NC craneales para una variedad de aplicaciones. Concebimos estudios sobre migración dirigida, migración e invasión 3D. Las células aisladas de esta manera pueden ser tratadasin vitropara una serie de análisis. Por ejemplo, las células se pueden tratar fácilmente utilizando diferentes moléculas pequeñas para apuntar a proteínas específicas, se pueden tratar en puntos de tiempo definidos, y los experimentos de lavado se pueden diseñar para determinar la recuperación de los comportamientos celulares (Figura 4). Es posible un cultivo a largo plazo para ensayos de transfección y diferenciación, así como el paso de células (datos no mostrados). Sin embargo, la viabilidad, la capacidad de renovación celular y la multipotencia deben validarse después del paso. Las células chapadas en tapas de vidrio también se pueden utilizar en protocolos de tinción inmunofluorescentes, después de imágenes en vivo. Por último, este enfoque representa un sistema tremendamente poderoso para estudiar la migración de NC a partir de modelos genéticos de ratones22,23,24,25.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la Unidad de Servicios Biológicos King’s College London, especialmente Tiffany Jarvis y Lynsey Cashnella por su continuo apoyo. Agradecemos a Derek Stemple, Mamoru Ishii y Robert Maxson por asesoramiento y ayuda con los reactivos durante el establecimiento inicial de este protocolo. Agradecemos a Dheraj Taheem por la ayuda con la irradiación gamma de células STO. Agradecemos a los laboratorios Liu y Krause, especialmente Tommy Pallett, por su gran apoyo. Este trabajo fue financiado por subvenciones de la BBSRC (BB/R015953/1 a KJL/MK), una formación estudiantil del Programa de Formación doctoral (LD del MRC), el Fondo de Pedley de Newland (ALM) y KRIPIS II, Secretaría General de Investigación y Tecnología (GSRT), Ministerio de Educación y Religioso Grecia y la Fundación Santé (a SGGM).

Materials

bFGF R&D systems 233-FB
b-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Tissue culture flasks Corning 430639 25cm2 culture flasks
DMEM (4500 mg/L glucose) Sigma D5671
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) Sigma D8537
Ethanol Fisher Chemicals E/0650DF/C17
Fetal Bovine Serum Sigma TFS AA 10-155
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) Gibco 26140079/16141-079
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
Gelatin from bovine skin Sigma G9382
L-glutamine Sigma G7513
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate Ibidi 82406 Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides
Cell migration analysis tool Ibidi v2.0 Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Circularity Plug-in ImageJ v1.29 or later The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIF ESGRO by Millipore ESG1106
Manual Cell Tracking Plug-in ImageJ v1.34k or later ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
MEM non-essential aminoacids 100X Gibco 11140-050
Matrigel (ECM-based Hydrogel) Corning 356234
Microscope Olympus 1X81 Olympus 1X81 inverted microscope
Microscope camera Photometrics 512B Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)
Microscope controller Olympus 1X2-UCB Olympus 1X2-UCB microscope controller
Microscope temperature controller Solent Scientific RS232 Maintained at 37°C
Penicillin/streptomycin Sigma A5955
Sodium Pyruvate Sigma S8636
Statistics software Graphpad Prism v7.0
STO feeder cells ATCC CRL-1503
Stereomicroscope Nikon SMZ
XY microscope stage controller Applied Scientific Instrumentation (ASI) MS-4400
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Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., Muñoz, A. M. L., Dawson, M., Barrell, W., Marangos, P., Krause, M., Liu, K. J. Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration. J. Vis. Exp. (152), e60051, doi:10.3791/60051 (2019).
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