神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

すべての動物の仕事は、キングスカレッジロンドン倫理レビュープロセスによって倫理的な承認を受けており、英国のホームオフィスプロジェクトライセンスP8D5E2773(KJL)に従って行われました。 1. 試薬の調製 滅菌リン酸バッファー生理食べ物(PBS)、70%エタノール、解剖ツール(鉗子および解剖ブレードまたは滅菌針)、市販の細胞外マトリックスでコーティングされたプラスチックプレートまたはガラススライドを含む一般的な解決策および用具を準備する(ECM)ベースのヒドロゲルまたはフィブロネクチン(材料表参照)、および神経堤媒体(下記参照)。 ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM、4500mg/Lグルコース)、15%胎児ウシ血清(FBS)、0.1mM最小必須必須非必須アミノ酸(MEM NEAA 100X)、1mMピルビン酸ナトリウム、55μM-βcapeを用いて神経堤基底培地を調製単位/mLペニシリン、100単位/mL連鎖球菌、および2 mM L-グルタミン。 増殖阻害STOフィーダー細胞21を用いて一晩培味物を条件付ける。 10Sおよび100 U/mLペニシリン、100 U/mL連鎖筋マイシンによって補充されたDMEMを含むSTO細胞(材料の表を参照)を調用する。STO細胞を成長させ、0.1%のゼラチンでコーティングした25cm2フラスコで合流するように膨張させる。ガンマ照射の5000ラッドを適用します。 種子約3 x 106成長抑制細胞を10cm2皿または25cm2フラスコ(ステップ1.2.1.1から)に付ける。約10-12 mLの神経堤基底培地を加え、一晩インキュベートする。注:シード細胞は、最大10日間条件付き培地を生成するために使用することができます。定期的にセルの外観を確認する 培地(0.22μmの細孔サイズ)を濾過し、25 ng/mLの基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)および1000Uの白血病阻害因子(LIF)を補う。注:4 °Cで保存し、1ヶ月以内に使用するか、-20 °Cで保存し、3ヶ月以内に使用します。 組織培養表面を細胞外マトリックスでコーティングする。注:尋ねられている生物学的な質問に応じて、マトリックスはガラス底の培養皿、プラスチック組織培養皿またはガラスカバースリップにコーティングすることができます。マトリックス基板に依存する異なるECMベースのヒドロゲル希釈については、以下を参照してください。フィブロネクチンは、ガラス底の皿でテストされており、カバースリップは、以下に指定された濃度でのみ。ここでは、基板被覆面を「被覆プレート」と呼びます。 組織培養面をECMベースのヒドロゲルでコーティングします。メモ:メディアを冷却するか、氷の上に保つことによって、メッキまで基板を冷やしてください。 ヒドロゲルを一晩4°Cで解凍する。DMEMで10Sの5 mLを10mLの最終体積のために5 mLのヒドロゲルに加えます(材料の表を参照)。 0.5~1 mLのアリコートを便利にして-20°Cで保存します。 氷の上でヒドロゲルアリコートを解凍します。 プラスチックをコーティングするためにヒドロゲルストックの1:20希釈を使用してください。 ヒドロゲルストックの1:5希釈を使用して、ガラススライドとガラス底組織培養プレートをコーティングします。注:冷たいDMEMでヒドロゲルを希釈します。 プレート/スライドに所望の領域をカバーするのに十分な希釈ヒドロゲルを適用し、37 °Cで30〜45分間インキュベートします。 コーティングされたプレート/スライドを直ちに使用するか、一晩4°Cでコーティングされたスライドを保管してください。 使用前に過剰を取り除き、高グルコースDMEM(オプション)でスライドをすすいでくしてください。 組織培養面をフィブロネクチンでコーティングします。 1 mg/mLフィブロネクチンストック溶液のアリコートを作り、-80°Cで保存します。ダルベッコのPBS(dPBS)を使用してフィブロネクチンを希釈し、最終的な濃度を1μg/mLにします。 所望の領域をカバーするために十分なフィブロネクチンを適用し、室温で15分間インキュベートします。 残留フィブロネクチンを取り除き、ガラスを30〜45分間乾燥させます。 使用前に高グルコースDMEM(オプション)でウェルをすすり、またはカバースリップしてください。 2. 1日目:初期ソミト期胚の解剖 注:滅菌ツールと滅菌液を使用してください。ジェノタイピングが必要な場合は、DNA抽出のために胚の体を採取する。 頭蓋神経板の解剖は、8.5日後のコイタム(dpc)で胚に制限される。5~8個のソミテ段階で胚を選択します。子宮をPBSに解剖し、各胚を分離するためにメムトリウムを切断する(図1A)。子宮の筋肉壁が収縮し、デシデュアル組織が見えるようになります(図1B)。注:解剖が一度に1つの胚を行っている間、氷冷PBSで子宮内の胚を維持する。ガラスのパスツールピペットで胚を新鮮な無菌PBSに移動し、可視性を向上させ、汚染を低減します。 筋肉層とデシデュアル組織の間に鉗子をスライドさせ、2番目の鉗子のペアで筋肉層を除去する(図1C)。 鉗子を使用して、メソームの極の端に決定機を突き刺し、2番目の鉗子のペアで引き裂いてポールに垂直に開きます。 鉗子でデシデュアル組織を剥がし、ライハートの膜を視覚化します。 ライハートの膜を慎重に取り除きます。内臓黄嚢が見え、胚が内部に見える(図1D)。 内臓黄嚢と天文(図1E)を取り除き、頭部の折り目を可視化するために胚を配置する(図1F)。 心臓の上に頭を折り、鉗子やまつげツールを使用して基礎となる中皮を削り取り、きれいな神経板(NP)を得ます(図1H)。注:NPは、各側面が個別にメッキできるように、前部柱軸全体または分割を保持することができます。神経板の境界は、移植片への神経の寄与を最小限に抑えるために、神経板からさらに離れてトリミングすることができます。 ガラスのパスツールピペットを使用して、解剖された神経板を、条件付きニューラルクレストメディアで満たされたヒドロゲルコーティングされた皿に移します。 ゆっくりと皿を旋回して、井戸の真ん中にNPを配置します。これは、生細胞イメージングの位相品質を最大化するために重要です(2日目)。 5%CO2で37 °Cで一晩(または所望の時間ポイントに)インキュベートする。神経堤細胞は、神経板から目に見えて移動する必要があります。注:セルは通常6~8時間以内に接続します。引き渡しが取り付けた後、移行セルを視覚化する時間を増やします。通常、24時間後の閉じ植えによって、我々は細胞の3つの区別可能な集団を見つけることができます。最初の母集団は、先実の中心に、神経板(NP)である。第2の集団である予見NC(pNC)は、細胞の上皮シート内のNPを囲む。第3の集団は、外側のリングで、大きさが大きい渡り来性NC(mNC)で形成され、完全に間葉系に見える(図2)。 3. 2日目:マウス頭蓋神経紋細胞の生細胞イメージング 注:画像化は、神経堤細胞の移行を最適に画像化し、定量化するために、移植後24時間で行われるべきである。NC誘導媒体は、生細胞イメージングの前にリフレッシュする必要はありません。モーターを備えた段階および組み込まれた環境部屋が付いている逆顕微鏡へのアクセスは要求される。イメージングに適したマルチウェル組織培養皿を使用してください(材料の表)。 顕微鏡セットアップ 環境室を37 °Cと5%CO2に設定します。 組織培養板蓋の蓋に穴を開けて、CO2加湿室に接続されたCO2針をプレート内に座らせた。 組織培養皿を試料ホルダーに入れ、プレート蓋とCO2針をテープで下ろし、マルチウェル獲得時の揺れを防ぎます。 顕微鏡コントローラ、ステージコントローラ、イメージングソフトウェアのスイッチを入れましょう。 10倍の倍率で頭蓋NC細胞に焦点を当てます(コンデンサーで一致する位相リングを使用)。 顕微鏡セットアップマニュアルに記載されているように、フィールドアイリスダイヤフラム、開口アイリスダイヤフラム、センタリング望遠鏡を調整することにより、顕微鏡上で高品質の位相コントラストを設定します。 位相コントラストライブセルイメージング タイムラプス ファイルを保存するディレクトリまたはファイルの場所を設定します。 露出時間、ビニング、カメラエリアを設定します。 時間ポイントの数、イメージングの期間、フレーム間の時間間隔を設定します。 NC細胞の移動能力を定量化するには、顕微鏡を10倍の倍率に設定し、5分毎に1フレーム(18時間以上の217時間のタイムポイント)を取ります。細胞形態を定量化するには、倍率を40倍に設定し、1フレーム/分(1時間以上の61時間の時点)を取ります。ラメリポダイヤルダイナミクスを定量化するには、倍率を40倍または60倍に設定し、10s(10分以上)ごとに1フレームを取ります。 マルチウェルイメージングの場合は、選択した XY 位置間を移動する機械ステージを設定します。頭蓋NC細胞が焦点を合わせており、ステージの位置が正しいことを確認します。 [取得]コマンドを使用して、タイムラプス イメージングを開始します。 タイムラプスイメージングが完了したら、多次元データを確認し、.stkファイルをエクスポートして分析します。注: .stk は TIFF スタック ファイルです。 ソフトウェアを終了し、コンピュータをシャットダウンし、ステージ、カメラ、顕微鏡コントローラをオフにします。 4. イメージング解析:神経堤細胞移動の定量化 注:マウス頭蓋神経紋細胞を移動することによって示される細胞行動をより良く定義するために、我々は、特に渡り容量と細胞形状のダイナミクスに焦点を当てて、一連の定量化可能な移行パラメータを分析しました。(1)マイグレーション(累積距離)は、セル(μm)によって撮影されたパスの全長です。(2)マイグレーション(ユークリッド距離)は、セルの初期位置と最終位置(μm)の間の直線距離です。(3)マイグレーション(セル速度)は、時間単位当たりのセル移動距離(μm/min)です。(4)セル形状(セル面積)は、セルで覆われた総表面です。イメージング顕微鏡に従ってピクセルをミクロンスケールに設定します。(A = Apx x Nピクセル、A px = ピクセル領域と Npx = ピクセル数。単位: μm2;(5)細胞形状(細胞円形)は、A=面積及びP=周長である1.0(4π(A/P2))の円数値で示される完全な円からの細胞形状の偏差である。 単一セルトラッキング注: NC セルの移動を測定するために、すべてのタイムラプス フレームにわたって個々のセルの XY 座標が生成されます。これにより、細胞移動の距離、速度、永続性測定の後続の分析が可能になります。 ImageJ を開き、データを TIFF スタック ファイルとしてインポートします。 [分析] をクリック|スケールを設定して、顕微鏡の設定に従って.stkファイルを調整し、ピクセル/μmで動作します。 [プラグイン] をクリックします |トラッキング |手動トラッキングは、画像J手動セルトラッキングプラグインを開きます。セルトラッキングを開始するには、[トラックの追加]を選択します。 基準点として核を使用して、タイムラプスムービーのすべてのフレームを通してセルを追跡します。注: 10 ~ 20 個のセルを、合計 60 個のセルを追跡する必要があります (n = 3)。タイムラプスの過程で細胞分裂を受ける細胞は、分析から除外されるべきである。 結果を保存して .csv ファイルとしてエクスポートします。結果は、すべてのフレームにわたって個々のセルトラック番号、スライス番号、XY座標を表します。 神経堤細胞移動能力の定量化 単一セルトラッキングデータを開きます(上記参照)。.csv ファイルを .txt ファイル形式に変換します。 移行ソフトウェア (材料の表)を開きます。[データのインポート]タブをクリックして、セル追跡データを .txt ファイルとしてインポートします。 データセットの下|初期化を行い、解析するスライスまたはフレームの数を選択し、フレーム間の XY キャリブレーションと時間間隔を設定します。[設定を適用]を選択して設定を保存します。 軌道プロットを形成するプロットデータシンボルを選択します。距離と速度の測定を定量化するには、統計記号を選択します。 軌道プロットをビットマップ (.bmp) ファイルとして保存し、距離と速度の測定を .txt ファイルとして保存します。[データの削除]シンボルを選択します。他のタイムラプス ファイルについても同じ手順を繰り返します。注: 軌道プロットを使用すると、タイムラプスムービーの過程で、特定のセル条件または状態に対する個々のセルパスの直接性を視覚化できます(図4A)。.txt ファイルに格納されている距離と速度のデータを使用して、さらなる分析を行うことができます。 神経堤細胞領域の定量化と円形性 ImageJ でタイムラプス .stk ファイルを開き、顕微鏡の設定に従って調整し、ピクセル/μm で動作します。 分析中|[測定値] を設定し、クリックしてセルシェイプ パラメータ (セル面積、周長、図形記述子) を選択します。 フリーハンド選択ツールを使用して、細胞膜境界をガイドとして使用して、各セルの周りを手動で描画します。 キーボードのCtrl キー + Bキーを押して、セルのアウトラインをイメージ上にオーバーレイします。各タイムラプス フレームでセルに対して繰り返します。 画像を使用する |オーバーレイ |値を格納するには ROI マネージャにします。 フレームごとの対象のすべてのセルの概要が表示されたら、[測定]をクリックします。結果を .csv ファイルとして保存します。注: ムービーごとに 10 ~ 20 個のセルを概説し、条件ごとに合計 30 ~ 60 個のセルを分析する必要があります (n = 3)。細胞形状データ(.csvファイル)を使用して、時間の経過に応えて細胞形状のダイナミクスがどのように変化するか(図4C)、または異なる細胞処理下で形態を変更する方法を定量化できます。