تشريح والثقافة وتحليل خلايا الجمجمة العصبية الابتدائية من الماوس لدراسة الخلية كريست العصبية الترقيم والهجرة
Summary
يصف هذا البروتوكول تشريح وثقافة خلايا الجمجمة العصبية القحفيه من نماذج الفئران ، وذلك في المقام الأول لدراسة هجره الخلايا. نحن وصف تقنيات التصوير الحية المستخدمة وتحليل التغيرات السرعة وشكل الخلية.
Abstract
علي مدي العقود العديدة الماضية كان هناك زيادة توافر نماذج الفئران المعدلة وراثيا المستخدمة لتقليد الامراض البشرية. ومع ذلك ، فان القدرة علي دراسة حركات الخلايا والتمايز في الجسم المجري لا تزال صعبه للغاية. الاعتلال العصبي ، أو اضطرابات السلالة كريست العصبية ، هي تحديا خاصا للدراسة بسبب عدم امكانيه الوصول إلى المراحل الجنينية الرئيسية والصعوبات في فصل من القمه العصبية mesسبي لي من المتاخمة الجلدية الوسطي. هنا ، ونحن المنصوص عليها لإنشاء بروتوكول محدده جيدا ، والروتينية للثقافة الاوليه الخلايا العصبية الجمجمة كريست. في نهجنا ونحن تشريح الماوس الحدود لوحه العصبية خلال الاوليه العصبية قمة مرحله الاستقراء. المنطقة الحدودية للوحه العصبية يتم شرحها واستزراعها. تتشكل خلايا القمه العصبية في ورقه الظهاريه المحيطة بحدود الصفيحة العصبية ، وبحلول 24 ساعة بعد الشرح ، تبدا في الفصل بين المراحل الانتقالية (EMT) لتصبح خلايا كريست العصبية بالبالكامل. ونظرا لنهجنا الثنائي الابعاد ، فانه يمكن تمييز مجموعات الانسجه المتميزة (الصفيحة العصبية مقابل القمه العصبية البرية والمهاجرة) بسهوله. باستخدام نهج التصوير الحي ، يمكننا بعد ذلك تحديد التغييرات في الاستقراء كريست العصبية ، EMT والسلوكيات المهاجرة. سيكون الجمع بين هذه التقنية مع المسوخ الوراثية نهجا قويا جدا لفهم البيولوجيا خليه كريست العصبية العادية والمرضية.
Introduction
السلالة العصبية كريست (NC) هو السكان عابره ومتعددة القوية والمهاجرة من الخلايا التي تظهر حصرا في الفقاريات خلال النمو الجنيني المبكر1,2. المشتقات كريست العصبية هي متنوعة للغاية ، وتشمل الخلايا غير المحببة ، والعضلات الملساء ، والخلايا الصباغية ، والخلايا العصبية وعظم الوجه الجمجمة والغضروف3،4. لان القمه العصبية تساهم في وظيفة العديد من أنظمه الأعضاء ، هذا النسب ضروري لتولد الاجنه البشرية. الشاذة NC التنمية متورط في مجموعه واسعه من العيوب الخلقية البشرية الأكثر شيوعا (اي ، الشفة المشقوقة والحنك)5، وأيضا اضطرابات مثل مرض هيرشسبرونغ (hscr) ، متلازمة وارنسبرغ (WS) ، متلازمة تهمه ومتلازمة ويليامز6 و7و8و9.
وقد تم استكشاف التنمية NC في عدد من النظم النموذجية غير الثدييات بما في ذلك xenopus, الفرخ ونماذج الزرد. في الثدييات, وقد حددت العمل في نماذج الفئران بعض الاحداث الوراثية الرئيسية الكامنة وراء تنميه كريست العصبية; ومع ذلك ، كان من الصعب متابعه بيولوجيا الخلية من الهجرة كريست العصبية ، وذلك بسبب عدم الوصول إلى الجنين الفار (استعرض في مكان آخر10،11). وعلاوة علي ذلك ، في حين ان الدراسات في الفرخ ، xenopus و الزرد إنشات شبكه الجينات التنظيمية NC ، فقدان الدراسات وظيفة في هذه النماذج الحيوانية في بعض الأحيان لا يحمل النمط الظاهري للمقارنة في الماوس. علي سبيل المثال ، في xenopus ، الزرد والفرخ ، والإشارات غير المتعارف عليها wnt هي واحده من أليات الخلوية التي تسمح NC للحصول علي قدرتها الهجرة12،13،14،15 . ومع ذلك ، في الماوس ، فقدان الإشارات Wnt غير المتعارف عليه لا يبدو ان تؤثر علي الهجرة16. كما هو الحال في NC الهجرة كان من الصعب تتبع لفترات طويلة في الماوس ، فمن غير الواضح ما إذا كانت هذه الأنواع-الاختلافات تعكس أنماط مختلفه من الهجرة ، أو الاختلافات في التنظيم الجزيئي.
كما لوحظ ، كانت دراسات NC في الماوس تحديا كبيرا لان ثقافة الاجنه السابقة للجنين شاقه. وعلاوة علي ذلك ، فان NC باستمرار في اتصال حميم مع الانسجه المجاورة مثل الأديم الوسطي و نيوريتوديرم. الاستخدام الأخير للسائقين Cre العصبية الخاصة كريست أو الاصباغ الخارجية قد سمح لنا لفلوريسسينتلي تسميه NC المهاجرة; ومع ذلك ، لا تزال هذه النهج محدوده. علي الرغم من تقارير متعددة تصف تقنيات مختلفه لتصور الهجرة NC17,18, وقد كان من الصعب حل هذه التقنيات في اجراء بسيط وروتيني.
ومن الواضح ان هناك حاجه إلى التقنيات التي تسمح بالتعامل مع وتوصيف NC الثدييات. ركزنا جهودنا علي الماوس الجمجمة NC كما هو النموذج الأساسي لدراسة التنمية البشرية القحف الوجه والأعصاب. قمنا بصقل نهجنا استنادا إلى عده تقارير مثيره للاهتمام تصف الثقافة الاساسيه للخلايا NC19،20،21. هنا ، ونحن تصف بدقه تقنيات الثقافة المثلي لاكسبلانتينج خلايا NC الاساسيه. ونحن نظهر طريقه التصوير الخلوي الحي والاستخدام الأمثل لمصفوفات مختلفه لطلاء لوحات الثقافة. بروتوكولنا يصف كيفيه التقاط الهجرة من الخلايا NC الحية باستخدام المجهر المقلوب ، والذي يهدف كمبدا توجيهي للاستخدام مع المجاهر الأخرى ، فضلا عن ملخص مفصل للتحليلات الخلوية لدينا.
يجب ان تكون النتيجة المتوقعة من الشرح الواضح توزيع الخلايا التي تتميز بوضوح تحت المجهر ، حيث يمكن للمرء ان يري ثلاثه من السكان مختلفه من الخلايا التي تمثل ‘ 1 ‘ الصفيحة العصبية ، ‘ 2 ‘ الهجرة المسبقة ، و ، ‘ 3 ‘ خلايا كريست العصبية المهاجرة. ونحن نظهر كيفيه تحليل سلوكيات الخلية علي الحدود بين السكان السابقين للهجرة من الخلايا خلال الانتقال الظهاريه-المستوي. كما ركزنا جهودنا علي دراسة الخلايا المهاجرة بالبالكامل لسرعه الخلية والمسافة وشكل الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت دراسة خلايا الثدييات العصبية الثديية تحديا للعلماء بسبب طبيعة الرحم في تنميه الثدييات. في الجسم الحي الدراسات من الصعب إنشاء ، كما يجب ان يتم التلاعب الجنين في ظل الظروف التي تحاكي الحياة في الرحم. في الممارسة العملية ، يكاد يكون من المستحيل ان التكرار الثقافة هذه الاجنه (+ +) لفتره أطول من 24 ساعة ، وخاصه بالنسبة للتصوير الحي. وعلاوة علي ذلك ، تحدث الاستقراء كريست العصبية والهجرة في وقت واحد مع إغلاق الأنبوب العصبي وتحول الجنينية في الماوس. هذا هو الحدث الحيوي والمجهدة المسببة للتوتر ، والتي تفشل في كثير من الأحيان عندما يتم استزراع الاجنه السابقين الرحم. التالي ، فان معدل نجاح النهج السابقة للولادة منخفض بشكل عام. استخدام خلايا NC الخلد21 هو أداه مفيده للحد من استخدام الحيوانية ، وانها قد توفر مصدرا أفضل من خلايا كريست العصبية للتحليل علي المدى الطويل ، الانتقال ، والدراسات التخصيب. ومع ذلك ، هناك حاجه واضحة إلى ثقافة الخلايا الاوليه العصبية بشكل موثوق. طريقتنا ينطبق علي الماوس ضرب الخروج أو النماذج الجينية المشروطة. وقد وصفت طريقه مماثله لنا لغيرها من السكان كريست العصبية20; ومع ذلك ، طريقتنا يصف بدقه العزلة خطوه بخطوه من خلايا NC الجمجمة murine. كما نقوم بوصف استخدام المصفوفات المختلفة وكذلك اجراء تحليل الهجرة بالتفصيل.
ولتحقيق نتائج متسقة ، وجدنا ان اهتماما خاصا قد دفع نحو التدريج اثناء اختيار الاجنه. ليس من المستغرب ، وعدد من الجسيدات يرتبط مع مراحل مختلفه في التنمية NC الجمجمة. ولذلك ، فان معرفه تشريح الجنين مهمة جدا قبل الحصول علي اي بيانات تجريبية. ويمكن بعد ذلك تكييف هذا النهج نحو عزل السكان المنفصلين من خلايا القمه العصبية ، اعتمادا علي السؤال البيولوجي والخلايا المستهدفة.
وبمجرد اختيار الاجنه وتشريحها ، يمكن تمييز الخلايا الجلدية الوسطي بسهوله وينبغي ازالتها للسماح بتصور أفضل وللحد من التلوث. للثقافات علي المدى الطويل ، يمكن أزاله انسجه الصفيحة العصبية في 24 ساعة من الطلاء من أجل منع التلوث بالانسجه العصبية. ويمكن لمزيد من الصقل ان يكون استخدام العلامات النسب الفلورسنت (علي سبيل المثال ، باستخدام Wnt1:: cre أو Sox10:: creert السائقين جنبا إلى جنب مع الصحفيين الفلورسنت24،25) للتمييز بين الخلايا كريست العصبية من الانسجه الأخرى كما هو مبين في الشكل 2C.
وقد سلطت التقارير السابقة الضوء علي إمكانات طلاء الماوس NC الثقافات التوضيحية علي المصفوفات المختلفة ، والأكثر شيوعا علي المائية ECM التجارية ، الفيبرونكتين والكولاجين انا20,21,26. في ايدينا ، تنمو بنجاح الثقافات التوضيحية NC الماوس الجمجمة علي جميع المصفوفات الثلاثة ، في تركيزات المحددة في التقارير الاصليه (البيانات لم تظهر). النهج المكرر الاوليه التي قمنا بتكييفها لدينا الثقافات التوضيحية NC استخدام هيدروجيل التجارية كمصفوفة من الاختيار ، والتي تتالف في المقام الأول من laminin و كولاجين21(الشكل 3الف – باء). ومع ذلك ، تكوين هذا هيدروجيل ليست محدده بوضوح ، مع عامل النمو غير معروف ومحتوي البروتين. علي هذا النحو ، لدينا منذ تحولت نهجنا لطلاء الماوس NC الثقافات التوضيحية علي الفيبرونكتين جنيني (الشكل 3C – D). يتم تعريف fibronectin جيدا والتعبير عنها بشكل كبير في ECM والاغشيه السفلي علي طول الخلايا NC التي تهاجرin vivo28,29,30. لتحسين مصفوفة الفيبرونكتين التي تحاكي أفضل العصبية الهجرة الخلية كريست والمورفولوجية كما راينا باستخدام هيدروجيل ، قارننا السلوكيات الخلية NC عرضت علي هيدروجيل ضد المعايرة من 0.25-30 ميكروغرام/مل الفيبرونكتين جنيني ، وتعريف 1 ميكروغرام/مل فيبرونكتين كما توفير خصائص مثاليه (لا تظهر البيانات). ونحن نعتقد ان هذا العمل التمهيدي قد يساعد في وضع اطار للمقارنة المنهجية للمصفوفات ، مثل الفيبروكتين ، ضد تلك التي سبق وصفها ، وهي الكولاجين والlaminin32,33,34. سيكون من المثير للاهتمام خصوصا مقارنه الماوس NC خليه الهجرة القدرة علي الفيبرونكتين مقابل الكولاجين الأول ، نظرا لان الكولاجين IA1 يفرز بواسطة الماوس ، الطيور وخلايا NC البشرية28,30,31,32. كولاجين [اي] لذلك بما ان مناسبه بما ان [فيبرونكتين] في النظر من مصفوفة اختبار. ومن الجدير بالتنويه أيضا ان التوافر البيولوجي لعوامل النمو في وسائل الاعلام يمكن ان تتغير من قبل مكونات مصفوفة مختلفه ، وخاصه بالنظر إلى محتوي المصل عاليه من وسائل الاعلام لدينا. وللتغلب علي ذلك ، نعمل حاليا علي إنتاج ظروف ثقافيه محدده خاليه من المصل. يتم استخدام هذه الوسائط المعرفة بنجاح في بروتوكولات التعريفي قمة العصبية في مجال الخلايا الجذعية مستحث ، ولكن تتطلب المزيد من التحسين لنظامنا الثقافة NC الشرح33,34. قد يكون عملنا أيضا بمثابه نقطه انطلاق لتحسين الظروف لأنواع أخرى من خلايا NC مثل القلب والجذع NC ، والدراسات اللاحقة من التمايز NC. والاهم من ذلك ، يسمح هذا البروتوكول بعزل خلايا NC الجمجمة لمجموعه متنوعة من التطبيقات. نحن نتصور دراسات حول الهجرة الموجهة والهجرة ثلاثية الابعاد والغزو. يمكن معالجه الخلايا المعزولة بهذه الطريقةin vitroلعدد من التحليلات. علي سبيل المثال ، يمكن معالجه الخلايا بسهوله باستخدام جزيئات صغيره مختلفه لاستهداف بروتينات محدده ، ويمكن علاجها عند نقاط زمنيه محدده ، ويمكن تصميم تجارب الغسيل لتحديد استرداد سلوكيات الخلايا (الشكل 4). ثقافة طويل الأجل لاختبارات التفاضل والتمايز هو ممكن ، فضلا عن مرور الخلايا (البيانات لم تظهر). ومع ذلك ، يجب التحقق من صلاحيه تجديد الخلايا والقدرة المتعددة بعد المرور. ويمكن أيضا ان تستخدم الخلايا المطلية علي الشفتين الزجاجية في بروتوكولات تلطيخ النيون ، بعد التصوير الحي. وأخيرا ، يمثل هذا النهج نظاما قويا بشكل هائل لدراسة هجره NC من نماذج الماوس الجينية22,23,24,25.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لوحده الخدمات البيولوجية التابعة لكليه الملك لندن ، وخاصه تيفاني جارفيس وليندا كاسهنيلا لدعمهما المستمر. نشكر ديريك Stemple ، مامورو ايشي وروبرت Maxson للحصول علي المشورة والمساعدة مع الكواشف خلال التاسيس الاولي لهذا البروتوكول. نشكر ديريج تاهيم علي المساعدة في تشعيع أشعه جاما لخلايا STO. ونحن نشكر مختبرات ليو و Krause ، وخاصه تؤمي Pallett ، لدعم كبير. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منح من BBSRC (BB/R015953/1 إلى KJL/MK) ، وهي دراسة من برنامج تدريب الدكتوراه في الجمهورية ، وصندوق نيولاند بيدلي (ALM) ، والامانه العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT) ، ووزارة التعليم والشؤون الدينية الشؤون ، اليونان ومؤسسه سانتيه (إلى SGGM).
Materials
| bFGF | R&D systems | 233-FB | |
| b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
| DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
| Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
| Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
| Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
| LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
| Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
| Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
| Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
| Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
| Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
| STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
| XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |
References
- Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
- Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. . The neural crest. 2nd edn. , (1999).
- Trainor, P. A. . Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , (2014).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
- Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung’s disease in patients with hypoplastic left heart syndrome–a common neural crest-derived etiology?. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
- Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
- Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
- Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
- Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different?. Development. 142, 1555-1560 (2015).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
- De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
- Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
- Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
- Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
- Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
- Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
- George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
- Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
- Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
- Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).
