Bu protokol, CD4+ T hücreleri ve sitokinlerde insan romatoid artritine daha yakın romatoid artrit modelleri oluşturmak için G6PI karışık peptidler kullanır. Yüksek saflıkta değişmez doğal katil T hücreleri (özellikle iNKT2) belirli fenotip ler ve fonksiyonlar ile in vivo indüksiyon ve in vitro saflaştırma ile benimseyici immünoterapi elde edildi.
Romatoid artrit (RA) karmaşık kronik inflamatuar otoimmün bir hastalıktır. Hastalığın patogenezi değişmez doğal katil T (iNKT) hücreleri ile ilişkilidir. Aktif RA’lı hastalarda daha az iNKT hücresi, kusurlu hücre fonksiyonu ve Th1’in aşırı polarizasyonu mevcuttur. Bu çalışmada hGPI325-339 ve hGPI469-483 peptidlerinin karışımı kullanılarak RA hayvan modeli oluşturulmuştur. in vivo indüksiyon ve in vitro saflaştırma ile elde edilen iNKT hücreleri, evlat edinen immünoterapi için RA farelere infüzyon uymaktadır. In vivo görüntüleme sistemi (IVIS) takibi, iNKT hücrelerinin esas olarak dalak ve karaciğerde dağıtıldığını ortaya çıkardı. Hücre tedavisinden sonraki 12 gün, hastalığın ilerlemesi önemli ölçüde yavaşladı, klinik semptomlar hafifletildi, timustaki iNKT hücrelerinin bolluğu arttı, timustaki iNKT1 oranı azaldı ve TNF-α, IFN-γ ve IL-6 düzeyleri serum azalmış. iNKT hücrelerinin benimseyen immünoterapi bağışıklık hücrelerinin dengesini geri ve vücudun aşırı iltihabı düzeltti.
Romatoid artrit (RA) kronik, progresif invazivlik ile karakterize otoimmün bir hastalıktır 0.5-1% insidansı1,2. Altta yatan patogenez, CD4+IFN-γ+ ve CD4+IL-17A+ T hücrelerinin oranında ki artış ve CD4 + IL-4+ve CD4 +CD25+FoxP3+ T hücrelerinin azalması ile kendini gösteren otoreaktif CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin anormal çoğalmasına bağlanır. Bu nedenle, inflamatuar sitokinlerin salgıları artar, ve aşırı inflamatuar reaksiyon vücudun bağışıklık sisteminin doğal denge ve tolerans fonksiyonu yok. Ayrıca, yardımcı T lenfosit (Th) 1 eklem nüfuz hücreleri inflamatuar yanıt ve eklem hasarı ağırlaştırmak. Bu nedenle, aşırı inflamatuar yanıt ın inhibisyonu ve bağışıklık toleransı ve bağışıklık dengesinin restorasyonu RAtedavisiiçinanahtar dır3 ,4.
iNKT hücreleri hem NK hücre li hem de T hücre fonksiyonlarına ve özelliklerine sahiptir. iNKT hücreleri sınırlı TCR β-zincir repertuvarları5 ile farklı, değişmez T hücre reseptörü (TCR) α-zincir barındırır ve büyük histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I molekülü CD1d tarafından sunulan glikolipid antijeni tanır. Mitsuo ve ark.6 RA dahil olmak üzere birçok otoimmün hastalıkta çok sayıda iNKT hücresi ve fonksiyonel defekt saptandı. Aurore ve ark.7, iNKT hücrelerinin otoimmün toleransı korumada olumlu bir etkisi olduğunu ve iNKT hücrelerinin sayısı ve işlevi geri yüklendiğinde hastalığın hafiflediğini göstermiştir. Buna ek olarak, Miellot-Gafsou ve ark.8 iNKT hücrelerinin sadece hastalığı ortadan kılmış değil, aynı zamanda hastalığın ilerlemesini artırdığını bulundu. Bu çelişkili sonuçlar, iNKT hücrelerinin heterojen T hücreleri olduğunu ve farklı alt kümelerin işlevinin tersine çevrilebileceğini düşündürmektedir. RA bir klinik çalışmada, iNKT hücrelerinin sıklığı hastalık aktivitesi nin skoru ile ilişkili9. Sonuçlar ayrıca RA hastalarında iNKT sıklığının azaldığını, CD4+IFN-γ+ T hücre alt kümelerinin sayısının arttığını ve inflamatuar sitokinlerin IFN-γ ve TNF-α salgı düzeylerinin10,11arttığını doğruladı. Buna ek olarak, Şerif ve ark.12 tip 1 diyabet (T1D) araştırılmış ve inflamatuar sitokin IL-4 ekspresyonu upregulated iNKT hücrelerinin seçici infüzyon, bağışıklık toleransı muhafaza ve tip 1 diyabet gelişimini engelledi bulundu. Bu nedenle, spesifik iNKT hücrelerinin benimseyen infüzyonu veya iNKT hücrelerinin hedefli aktivasyonu RA hastalarında iNKT hücrelerinin düzeyini artırır, ra tedavisinde bir atılım olabilir.
Hücresel immünoterapi şu anda büyük ilgi ve yaygın kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Ancak, iNKT hücreleri nadir, heterojen immünodüzenleyici hücrelerdir (toplam PBMC sayısının sadece %0.3’ü)13, bu da potansiyel klinik uygulamaları sınırlar. Bu hücreler esas olarak üç alt popülasyona ayrılır: 1) promiyelositik lösemi çinko-parmak proteini (PLZF) ve T-box transkripsiyon faktörü (T-bet) yüksek bir ekspresyona ya da iNKT1 hücreleri; 2) PLZF ve GATA bağlayıcı protein 3 (GATA3) ara ekspresyonu ile iNKT2 hücreleri; 3) PLZF ve retinoid ile ilgili yetim nükleer reseptör düşük ekspresyonu ile iNKT17 hücreleri (ROR)-γt bu salgıif IFN-γ, IL-4, ve IL-1714. Aktive iNKT hücreleri th1 salgılar, Th2, ve Th17 benzeri sitokinler, hangi iNKT hücrelerinin farklı immünomodülatör etkilerini belirlemek15. iNKT hücrelerinin çeşitli alt popülasyonlarının spesifik aktivasyonunun immünomodülatör ve immünoterapötik etkileri farklıdır. Bu nedenle, vücudun bağışıklık yanıtını düzenleyen anti-inflamatuar fonksiyonlar ile iNKT hücrelerinin belirli fenotiplerin seçimi (özellikle iNKT2) RA bağışıklık dengesizliği ve bağışıklık bozuklukları düzeltebilirsiniz.
İdeal bir hayvan modelinin oluşturulması RA patogenezinin tedavisi ve incelenmesi açısından büyük önem eve sahiptir. Şu anda, en sık kullanılan ve olgun hayvan modelleri kollajen kaynaklı artrit dahil, adjuvan artrit, zimozan kaynaklı artrit, ve polisakkarit kaynaklı artrit16–17. Ancak, tamamen insan RA tüm özelliklerini simüle edebilirsiniz hiçbir model yoktur. Tip II kollajen kaynaklı artrit (CIA) klasik artrit modelidir. CIA tip II kollajen spesifik monoklonal antikorlar ile farelerin aşılanması ile indüklenen, Bu hastalık modelinin antikor bağımlılığı yansıtan. Benurs ve ark. duyarlı fare suşlarında periferik simetrik poliartrit indükler glukoz-6-fosfat izopir (G6PI), sistemik bağışıklık yanıtı olan bir model tarif18,19. Bu modelde, artrit gelişimi T hücrelerine bağlıdır, B hücreleri, ve doğuştan bağışıklık18,19,20. Horikoshi21, DBA/1 farelerinin G6PI polipeptid parçaları ile bağışıklanması sonucu ortaya çıkan RA modellerinin, CIA modellerine göre CD4+ T hücreleri ve sitokinler (yani IL-6 ve TNF-α) açısından insan RA’sına daha çok benzediğini buldu. TCR tanıma yerinde uyarıcı etkiyi artırmak için, Ra fare modelini oluşturmak için DBA/1 fareleri aşılamak için G6PI’nin (hGPI325-339 ve hGPI469-483) karışık polipeptit parçaları kullanıldı. HGPI325-339 ve hGPI469-483 I-A q-kısıtlı T hücre yanıtları için immündominant olduğu için bu yaklaşımın başarı oranı yüksek olabilir. Bu nedenle, bu model RA hastalarında CD4+ T hücrelerinin aşırı çoğalmasını ve iNKT hücre defektlerini simüle edebilir22. RA immünpatolojisinin temel araştırmaları daha derinlemesine araştırmamızın temelini attı.
iNKT hücreleri doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığı kapatan özel T hücreleridir ve esas olarak CD4++/CD8+ timositlerden geliştirilmiştir. iNKT hücreleri farklı immündüzenleyici fonksiyonlara sahiptir ve farklı sitokinlerin doğrudan temas ve salgılanması ile diğer bağışıklık hücreleri ile etkileşim23, dendritik hücreleri etkileyen (DC), makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, T hücreleri, ve NK hücre farklılaşması v…
The authors have nothing to disclose.
Çalışmamız Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC) (81771755), Kolejler ve Hebei eyaleti (ZD2017009) kolejleri ve üniversitenin bilim ve teknoloji anahtar araştırma projesi ve Hebei Üniversitesi Hayvan Laboratuvarı Tıbbi Deney Merkezi tarafından desteklenmiştir. Desteklerinden dolayı minnettarız.
Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF | BD | 563490 | America |
Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-048-801 | Germany |
Columns | Miltenyi | MS | Germany |
Cryogenic Centrifuge | Beckman | Allegra® X-15R | America |
DiR | Thermo Fisher Scientific | D12731 | America |
Embedding Center | Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. | BMJ-1 | China |
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain | BD | 553170 | America |
Flow cytometer | BD | Accuri C6 | America |
Freund's complete adjuvant | Sigma | F5881 | America |
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) | Karebay Biochem | 18062202 | China |
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) | Karebay Biochem | 18062203 | China |
In Vivo Imaging System | PerkinElmer | caliper IVIS lumina II | America |
Ionomycin Calcium | Cayman | 10004974 | America |
KRN7000 | AdipoGen | AG-CN2-0013 | America |
Mouse CD1d Tetramer-PE | MBL | TS-MCD-1 | Japan |
Mouse percoll | Solarbio | P8620 | China |
Optical Microscope | Olympus | Olympus-II | Japan |
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt | BD | 562683 | America |
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet | BD | 561316 | America |
Pertussis toxin | Sigma | P7208 | America |
phorbol esters | Cayman | 10008014 | America |
Red Blood Cell Lysis Buffer | BD | 555899 | America |
RPMI-1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | Israel |
Th1/Th2/Th17 cytokines kit | BD | 560485 | America |
Ultramicrotome | Leica | Leica EM UC6 | Germany |