单分子Fürster共振能量传递方法，用于GEN1对霍利迪结分辨率进行实时调查

1. 表面功能化盖玻片的制备 清洗 将五个盖玻片（24 毫米 x 60 毫米）放入可克林罐内的乙醇中。在乙醇中声波，然后在1M氢氧化钾中30分钟3倍。用丙酮3x洗涤，然后去皮。 锡兰化 在丙酮中制备2.8%3-氨基丙酸二甲烷（APTES）溶液。用石蜡薄膜密封 APTES 瓶，并储存在 4°C。注：使用安全护目镜并在烟罩下工作。硅烷溶液的容器应在将硅烷溶液倒入罐中之前和之后，立即用丙酮完全干燥并冲洗。 将 2.8% APTES 溶液的 70 mL 倒入包含盖玻片的 Coplin 罐中。在轨道摇摇器中摇动罐子 4 分钟。 让罐子在长凳上站立5分钟，隔音1分钟，最后将罐子放在长凳上10分钟，让硅烷与玻璃表面的羟基组发生反应。 将水直接倒入罐中，以快速换溶剂，加入1L的去离子水，使反应淬火。将罐子侧身摇动，在平坦的表面上将滑轨在水中冲洗 3 倍。 从罐子中取出盖玻片，放在铝箔托盘上。在 110°C 的烤箱中烘烤盖玻片 30 分钟，干燥盖玻片并固化硅烷。将托盘放在工作台上，让盖玻片冷却至室温。 佩吉格 加热生物素化 PEG 和 PEG，储存在 -20°C 至室温 （RT）， 以防止打开容器时水分凝结。 将五个盖玻片与硅化表面朝上放在一个盒子上。沿硅化盖板的边缘放置两个盖玻璃滑片（22 mm x 22 mm）。 一旦预热，通过在1.5 mL管中加入1.5毫克生物浸化PEG和150mgPEG，在1mL的新鲜、0.1M碳酸氢钠溶液中，以±1：100的比例制造生物浸化PEG和PEG溶液。 涡旋管溶解PEG并向下旋转以去除气泡。注：从此步骤开始，要快速进行，因为 PEG 在最小时间范围内在溶液中水解。 快速将 PEG 溶液的 100 μL 应用于每个盖玻片。取另一个烤盖玻片，并将其上部硅化表面面朝下放在带有 PEG 解决方案的盖玻片顶部，从而形成玻璃溶液玻璃夹层，其中 22 mm x 22 mm 非硅化盖玻片允许两个功能化盖玻片容易分离。 在黑暗中和RT处孵育覆盖物过夜（16小时）。孵育完成后，将盖玻片拆开，然后用去离子水冲洗10倍，用喷瓶从侧面清洗。 在干氮流下干燥盖玻片。将干盖玻片存放在真空下。注：幻灯片可以使用 1 个月，而不会降低质量。 2. 流动单元的制备 单通道流单元 在石英滑梯的中间部分（50 mm x 20 mm）钻两个直径为 1.22 mm 的孔，中心与滑轨边缘相距 37 毫米，距滑道边缘 6.5 mm（图 1A）。 使用电子切割机将 41 mm x 2.25 mm 通道切割成 50 mm x 20 mm 的双粘合片。 剥下保护盖的塑料侧，将件的边缘与石英滑动的边缘对齐。用一对聚四氟乙烯钳轻轻压住的气泡，清除被困的气泡。 剥去粘合件的纸面。将件安装到盖玻片的功能化表面上。 将聚乙烯管（I.D. 1.22 mm）切成 11 厘米的长度，用于入口，将出口切至 25 厘米。将管插入先前钻孔，作为流单元的入口和出口。 使用 5 分钟环氧胶密封石英盖玻片界面的边缘以及入口和出口的管周围。 一旦流电池干燥或在干真空下储存，立即使用，以便以后使用。 在PBS中溶解阿金，浓度为0.03mg/mL。过滤通过0.2μm注射器过滤器。 使用 1 mL 注射器将阿维金流入流细胞。使用另一个装满缓冲液的注射器来洗掉多余的阿丁。更换注射器时，小心不要引入气泡。 多通道流单元 在石英滑梯的长边（76 mm x 25 mm）上钻出六个直径为 1.22 mm 的孔（图 1B）。使孔距滑轨边缘 4.5 mm，将孔分开 9.3 mm。确保每个孔对的中心之间的距离为 15 mm。 使用电子切割机将 6 个通道（20 mm x 2.25 mm）切割成 76 mm x 25 mm 的双胶带。 剥下保护盖的塑料侧，将粘合件的边缘与石英滑动的边缘对齐。使用一对聚四氟乙烯钳子轻轻按压，清除任何被困的气泡。 剥下粘合件的纸张侧，并安装在盖玻片的功能化表面上。注：有时剥离纸张侧并附着在石英滑块上，在多通道流单元中工作良好。 切割六个通道的进气管（11 厘米）和出口管（25 厘米）。如步骤 2.1.6_2.1.9 所述准备流单元。 将第一个通道的插座连接到泵。使用 OSS 将入口放入 0.5 mL 管中。注：选择入口管的长度，通过酶进入流细胞的同步时间和成像的开始，使连续流下进行的裂解实验中的事件数最大化，从而减少荧光。 通过断开已用通道的插座，移动到新通道。用用塑料部分用胶水密封的注射器针制成的插头关闭出口。关闭已用通道的入口。 3. 准备氧气清除系统（OSS） 在800μL甲醇中溶解0.2克（+）-6-羟基-2，5，7，8-四甲基铬-2-碳水化合物酸（三重状态淬火，以尽量减少荧光量闪烁）。 加入6 mL的去离子化H2O，并添加1个N NaOH滴落，直到它溶解。过滤通过注射器过滤器，成1 mL等分，并储存在-80°C。库存浓度为 ±100 μM。 通过在 4 mL ddH2O 中溶解 61 mg PCA 粉末，制备 3，4-二氧基苯甲酸 （PCA） 的新鲜溶液。库存浓度为 ±100 nM。 滴滴加入 58 μL 的 10 N NaOH，确保每次滴落后涡流，直到 PCA 完全溶解（pH = 9）。 在7 mL的PCD储存缓冲液中溶解5.3毫克原醇3，4-二氧酶（3，4-PCD）（表1）。3，4-PCD通过催化原酸34的氧化，从结合/裂解缓冲液中去除氧气。 将 PCD 溶液划分为 1 mL 等分。库存浓度为±1 μM.将液氮中的等分物冷冻在-80°C，用于长期储存或-20°C储存，用于短期储存。 准备一个新的绑定缓冲区 （表 1.将 2 mM CaCl2替换为 2 mM MgCl2，用于 smFRET 裂解实验。 准备1 mL的成像缓冲液 （表 1）。将成像缓冲液保存在冰上，直到它被引入流单元以保持氧气清除系统的活性。 4. 制备荧光标记的HJs 在Tris-EDTA缓冲液（表1）中重组冻干寡聚子（表2）至浓度为100μM。 通过混合表 1中列出的每个 X0寡聚物的等值部分 #3 μL 来制备合成结。 在 95°C 加热 5 分钟，然后以 1 °C/min 的速度缓慢冷却到 RT。使用热块或 PCR 热循环器达到所需的冷却速率。 将混合物加载到 8 厘米 x 8 厘米的 10% Tris-硼酸盐-EDTA 聚丙烯酰胺凝胶上。应用 100 V 并运行凝胶 ±2 小时。带子的眼睛清晰可见，颜色是紫色的。 用干净的刀片去除退火基板的带。将凝胶片转移到高压灭1.5 mL管中。 用干净的柱塞粉碎管内的凝胶片，然后加入100 μL的TE100缓冲液（表1）。 在热混合器中以 1，500 rpm 在 20°C 下摇动管，在 ±2 h 处或在 4°C 下孵育过夜，从而提取 HJ。 对含有基材的溶液35执行乙醇沉淀。 在 TE100 缓冲液的 20 μL 中重新悬浮基板 （表 1）。最终浓度为1~3μM.Aliquote 2 μL，储存在-20°C。 5. GEN1的蛋白质表达和纯化 用输入向量的PCR在C-总站20处用六角体异氨酸标记，构造被截断的人类GEN111、2、3、4、5的表达质粒。注： N 终端标记将导致 GEN1 停用。非结构化的 C 尾使全长度 GEN1 的纯化更加困难。此外，据报道，全长GEN1表现出的活动比截断版本23少。 将表达载体转化为大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3） -RIPL菌株。 在 37°C 下，将转化后的细胞接种成两个 6 L 烧瓶，每个烧瓶在 37°C 下含有 2 L 的 Luria 肉汤介质，在 180 rpm 下摇动，直到达到 OD600的 0.8。 冷却至16°C，诱导GEN1表达与0.1 mM等丙基-β-d-硫丙酮（IPTG）48小时。 在离心机中，在1000 x g下，在4°C下旋转细胞，收获细胞。每升培养的颗粒可产生 5~6 克的颗粒。 丢弃上清液，并使用4 mL/g的细胞重新悬浮在赖舍缓冲液中的颗粒细胞（表1）。 在30 kPsi下使用细胞干扰器进行细胞分解，然后在10，000 x g下在4°C下旋转1小时。使用 0.45 μm 过滤器收集上清液并将其过滤在冰上。 使用FPLC使用滤液以2.5ml/min流速通过5mL Ni-NTA柱，使用缓冲液A（表1）。执行蛋白质纯化。 用 15 列卷 （CV） 洗涤。具有缓冲器 A 和 500 mM Imidazole 的线性梯度，在 5 mL 分数中超过 20 CV。GEN1 在大约 100 mM Imidazole 的柱中洗脱。 移液器 10 μL 等分从收集的馏分，添加相等体积的 2x SDS 加载染料到每个等分。通过在 90°C 加热 5 分钟、冷却和旋转样品来使样品变性。 将样品加载到 10% 比斯-特里斯凝胶上。使用库马西亮蓝色，在 200 V. 染色处运行凝胶 30-45 分钟，然后脱色。收集包含纯化 GEN1 的分数。 使用缓冲液C（表1）稀释，将组合馏分的盐浓度降低至100 mM。 使用缓冲液B（表1），以3 mL/min的流速将低盐蛋白通过5 mL肝素柱。 使用 20 CV 的梯度与缓冲器 B 和 1 M NaCl 一起使用 10 CV 洗涤。收集 5 mL 分数，其中 GEN1 在 360 mM NaCl 周围洗脱。 检查纯化的 GEN1 分数的洗脱分数，如步骤 5.8 中所述。结合这些分数，并使用缓冲液C稀释至100 mM NaCl。 使用缓冲器 B 以 1 mL/min 流速将较低的盐蛋白加载到阳离子交换柱上。 使用缓冲器 B 和 1 M NaCl 的 40 CV 梯度洗取。收集 1.7 mL 分数，其中 GEN1 在 300 mM NaCl 周围洗脱。 检查步骤 5.8 中描述的洗脱分数中的 GEN1 纯度。 将最纯净的分数在 4°C 下与存储缓冲器结合 （表 1）。在透析期间至少进行一次缓冲液的交换。 测量蛋白质浓度 ±0.5±1 mg/mL。将透析蛋白在小管中10~15μL体积中与分，在液氮中闪冻，储存在-80°C。 6. 单分子FRET实验 注：smFRET实验在基于定制目标的TIRF设置（图1C）上执行，前面描述的31。 单色 FRET 实验 在 100x TIRF 目标上涂抹一滴浸入油。将 EMCCD 设置为适当的增益，以将信号优化到背景并防止饱和。注：对齐激光时，不要直视激光束并佩戴护目镜。 小心地将流动单元放在样品架上。使用粗调节逐渐提高目标，直到机油接触盖玻片。 打开绿色激光 （532 nm）。切换到目标精细调整模式。将发射定向到摄像机端口以观察监视器上的图像。 调整目标的高度，直到盖玻片的功能化表面对焦，并可在监视器上观察。注： EMCCD 采集的图像通过光通可调滤波器 （AOTF） 触发激光激发，以防止在未采集图像时样品光漂白。 在荧光标记的 HJ 中流动之前，检查盖玻片功能化表面的背景是否不超过几个点。 在 TE100 缓冲液中稀释库存基板约 1000 倍（表 1），最终浓度为 1~5 nM。用OSS将稀释的基板0.2±0.5μL移液到120μL的成像缓冲液中，并放入0.5 mL管中。 将流动单元的出口连接到注射器泵。将流动细胞的进气管插入 1.5 mL 管中，以 30*50 μL/min 的流速操作注射器泵，以从管中取出溶液。 通过使用绿色激光进行简要成像，经常检查表面的覆盖率（100~300均匀分布、间隔良好的基板）。 如果表面覆盖仍然不足，请等待几分钟，等待溶液中带有荧光标记的 HJ 沉降到表面上或重复流动步骤。 以30~50μL/min流下另外120μL的成像缓冲液（表1），以清洗未结合的荧光标记HJ。然后让流动单元坐5分钟，让OSS耗尽溶解氧。在成像开始时，荧光团的光漂白应是最小的。 设置曝光时间（+60毫秒），周期时间将由软件根据数据传输速度（±104 ms）自动设置，并指定所需的周期数或帧数（+400）。来自捐赠者 （Cy3） 和受体 （Alexa Fluor 647） 的发射通过图像分路器设备分裂成两个颜色通道。 在曲面上找到合适的区域，通过调整目标的高度对焦图像并记录，并将影片保存为 16 位 TIFF 格式。 移动到新区域。注：始终仅朝一个方向移动（即，从出口到入口），以避免对同一区域成像两次。 在 120 μL 的成像缓冲液中一次制备 1、2、5、10、25、50、75 和 100 nM GEN1。以 30-50 μL/min 的流速流溶液。注： 如果在稳定状态下完成所需的测量，如 GEN1 对 HJ 的绑定或游免费 HJ 的等同化，则在流量停止后等待 3-5 分钟以录制影片。为每个 GEN1 浓度从新区域获取三到四部电影。 如果在 GEN1 的 HJ 裂解下连续流下进行测量，则在 GEN1 进入流单元之前开始记录 5-10 s。通过移动到六通道流单元中的新通道来重复测量。 最后，使用固定荧光珠滑块在图像分割装置中将供体和受体颗粒彼此映射。 将直径为 1 μm 的 0.2 μL 荧光珠加入 500 μL 的 1 M Tris（pH = 8.0），使珠子粘附在表面。 在 22 mm x 22 mm 的双面粘合密封件内切割方形（18 mm x 18 mm）。剥下，将件子粘在 76 mm x 25 mm 石英滑块的中间。 将 50 μL 的稀释珠溶液放置，并放置 5-10 分钟以稳定。在方形件的顶部安装 22 mm x 22 mm 盖玻片。用纸巾干燥多余的珠子溶液，然后用环氧胶密封腔室。 在 60 ms 曝光时获取 100 帧的珠子滑动。注意：将激光功率和 EMCCD 增益降至最低，以避免探测器饱和。 安装软件包（例如，双音），并打开其中的电影，如用户手册36所示。选择供体和接受器通道中单个珠子的位置。生成如手册中所述的转换矩阵。注：本软件使用变换矩阵来匹配粒子在供体和接受器通道中的位置，并纠正图像分割装置中任何轻微的错位。 转到文件，按加载影片，然后选择影片文件，然后按打开。在文件菜单中，按Load TFORM并选择从珠子幻灯片生成的转换矩阵。调整供体和接受者通道的阈值，直到不包含误报。 在”通道”筛选器菜单中，选择”D&Amp”选项，以选择同时标有供体和接受方标记的粒子。检查最近邻限制字段以排除彼此非常接近的分子。检查最大椭圆度以排除非常偏心的分子，并检查宽度限制以排除非常宽或非常窄的分子。 按双音手册中的指示键入图解，以构造直方图。注： “明显”FRET 效率由程序计算，方法是将接受方的排放除以供方和接受方的总排放量。双色使用 100 个间隔将分子状态的分布与 FRET 效率进行比。 按双音手册中的指示，键入图解时间跟踪CW，以生成每个分子的时间跟踪。注： vbFRET37可以进一步分析时间跟踪，以识别不同的 FRET 状态、各自的住用时间和不同状态之间的转换速率。 双色交替激励FRET（ALEX）实验 用绿色和红色激光直接激发，分别记录由连续帧的供体和受体发射组成的电影，每个时间为80毫秒。 打开两个色调的获取的 ALEX 电影。将三个通道的适当检测阈值设置为+300：由于供体激发（DexDem）引起的供体排放;供体激发引起的接受物排放（DexAem）;和接受器发射由于直接激发（AexAem）。 应用通道过滤器 DexDem&DexAem，为同时具有供体和接受体的粒子进行选择。将粒子在三个通道中链接 [200]300。 使用绘图组 MATLAB 代码生成 ALEX 直方图。使用原点软件38将直方图中的不同峰值拟合到高斯函数，并确定曲线下每个总体区域的百分比。注： 绑定测定中的峰值对应于绑定的 GEN1-HJ 复合体，而在空闲 HJ 中，峰值表示互交等构体。 使用绘图TimetraceALEX MATLAB代码为每个分子生成时间跟踪，通过直接激发显示供体发射，以及由于FRET和直接激发而接受的发射。注：ALEX 时间跟踪独立显示供体和受体的排放量，但时间分辨率低于单色 FRET。与单色 FRET 类似，vbFRET 可以进一步分析 ALEX 时间轨迹，以识别不同的 FRET 状态及其各自的活动时间。 通过将绑定总体与 GEN1 浓度的百分比拟合到双曲函数，确定解散常数。 时移单色 FRET 根据观测到的动态速度，将绿色激光的曝光时间设置为 60 ms，将循环时间设置为 624 ms 或更低。 在六通道流单元的一个通道中，将流速设置为 110 μL/min。在 GEN1 进入流单元之前，先短暂开始记录。注：连续流动会导致荧光团的快速光漂白，因此同步成像和蛋白质输入的启动可最大化捕获事件的数量。最佳注射器泵读数取决于用于组装流细胞的死体积和精确管材;在我们的例子中，它是 +25 μL。 以 78 秒的总采集时间获得 125 帧的影片。在录制结束时，将样品暴露在红色激光中，每个50帧，曝光时间为25毫秒，以探测接受者。注：该方法通过减少激励周期数，延长了裂解实验中的观察窗口。通过将分布拟合到双指数模型30、38来派生动力学参数，如二分化的k开和k。 7. 电泳移动移位测定（EMSA） 在 50 μL 总体积中，在 EMSA 结合缓冲液（表 1） 中，用 50 pM Cy5 标记 HJ 在 RT 孵育所需的 GEN1 浓度 30 分钟。 将样品加载到 8 厘米 x 8 厘米的 6% 三聚物-EDTA 凝胶上。在 RT 处使用 100 V 在 1x TBE 缓冲液中运行凝胶 1 小时 + 20 分钟。 确定GEN1浓度的带束基板的百分比，从其相对于其对相应通道的总荧光强度的贡献。注：GEN1单体-HJ（波段I）通过其尺寸与GEN1单体与刻有HJ21、30的皮卡莫拉尔结合的协议确定。GEN1-dimer-HJ被分配到波段II，因为GEN1单体逐步结合到HJ21，23。 使用公式计算明显绑定常量Kd 单体应用-EMSA和Kd-dimer-app-EMSA：其中：最大值是相应物种达到最大结合的浓度（单体或二分体）;n 是希尔系数;Kd-app-EMSA是相应物种的明显结合常数，表示存在半最大值单体或二聚体的 GEN1 浓度。