Biomecánica endotelial perturbando a través de Connexin 43 Interrupción Estructural

El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología¹. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa^{2 ,3,4,5,6}. Los resultados obtenidos de métodos anteriores han sugerido que las tensiones mecánicas derivadas de células desempeñan un papel crucial en la determinación del destino de una serie de procesos celulares^3,4,5. Por ejemplo, al exponerse a una fuerza mecánica externa, un grupo de células que migran como colectivo puede alterar su morfología y polarizar su forma para alinear y migrar a lo largo de la dirección de la fuerza aplicada, en parte, generando tracción^{7, 8}. Las tracciones proporcionan una métrica que se puede utilizar para evaluar la contractilidad celular y se calculan mediante microscopía de fuerza de tracción (TFM). La microscopía de fuerza de tracción (TFM) comienza con la determinación de deformaciones de sustrato inducidas por células seguidas por el cálculo del campo de tracción utilizando un enfoque computacional matemáticamente riguroso y basado en la mecánica. Dado que la capacidad de calcular las tracciones ha existido durante bastante tiempo, los investigadores han utilizado TFM para revelar el impacto que las tracciones tienen en una serie de procesos, incluyendo el cáncer^9,la cicatrización de heridas¹⁰ y la evaluación de tejido¹¹.

La implementación de TFM y MSM juntos se puede dividir en tres pasos esenciales que deben ejecutarse en el siguiente orden: primero, se determinan las deformaciones de hidrogel producidas por las células; en segundo lugar, las tracciones se recuperan de las deformaciones de hidrogel; y en tercer lugar, se utiliza un enfoque de elementos finitos para calcular tensiones intercelulares normales y cortantes dentro de toda la monocapa. Para calcular los desplazamientos de gel, las imágenes de perlas de fluorescencia con células se compararon con la imagen del cordón de referencia (sin celdas) mediante una rutina de velocimetría de imagen de partículas (PIV) escrita a medida. El tamaño de la ventana de correlación cruzada y la superposición para el análisis PIV se eligieron para ser de 32 x 32 píxeles y 0,5, respectivamente. En este momento, los cambios de píxeles se convirtieron en micras multiplicando con un factor de conversión de píxel a micra (para nuestro microscopio, este factor de conversión es 0,65) para obtener desplazamientos en el plano. Los errores asociados con ignorar desplazamientos fuera del plano son insignificantes^12,13. Después del cálculo de los desplazamientos de gel, hay dos tipos de mediciones de tracción que se pueden utilizar, tracciones restringidas y tracciones sin restricciones^8,14. Las tracciones sin restricciones proporcionan el campo de tracción para todo el campo de visión (incluidas las regiones con y sin celdas), mientras que las tracciones restringidas proporcionan el campo de tracción solo para las regiones que incluyen las celdas¹⁴. A continuación, las tensiones intercelulares se calculan mediante microscopía de tensión monocapa (MSM), que es una extensión de la microscopía de fuerza de tracción. La implementación de MSM se basa en la suposición de que las tracciones locales ejercidas por una monocapa de células en la interfaz célula-sustrato deben equilibrarse mediante fuerzas mecánicas transmitidas entre células en la interfaz de células celulares según lo exigido por las leyes 7 de Newton ^,12,13. Una suposición clave aquí es que la monocapa de celda se puede tratar como una hoja elástica delgada porque se conoce la distribución de tracción en la monocapa y el equilibrio de fuerza no depende de las propiedades del material celular. Otra suposición clave es que las fuerzas de tracción están equilibradas por tensiones intercelulares locales dentro del campo de visión óptico (dentro de la monocapa) y la influencia de este equilibrio de fuerza es mínima en la región distal (fuera de la monocapa)¹³. Por lo tanto, las condiciones límite definidas por tensiones intercelulares, desplazamientos o una combinación de ambos en el límite monocapa son cruciales para realizar MSM¹³. Teniendo en cuenta la información anterior, utilizamos MSM para realizar un análisis de elementos finitos (FEM) para recuperar la tensión principal máxima_(máx.)y la tensión principal mínima_(min)girando el plano de tensión en cada punto dentro del Monocapa. Estas tensiones principales se utilizan posteriormente para calcular la tensión intercelular normal promedio 2D [((max + ?_min) /2] y la tensión intercelular de cizallamiento máxima 2D [(máx. –_min) /2] dentro de toda la monocapa ^12,13. Este procedimiento es descrito con más detalle por Tambe et al.^12,13

La microscopía de tensión monocapa (MSM) permite el cálculo de tensiones intercelulares de células celulares generadas dentro de una monocapa^6,7,8,12,13. Estas tensiones intercelulares se han sugerido para ser importantes para el crecimiento y reparación de tejidos, cicatrización de heridas, y metástasis de cáncer^12,15,16,17. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares también son importantes en la migración de células endoteliales y la función de barrera endotelial^17,18. Mientras que las uniones de células celulares tales como uniones estrechas y uniones adheridas han sido sugeridas para desempeñar un papel crítico en la generación y transmisión de estrés intercelular endotelial, el papel de las uniones de separación sigue siendo esquivo. Las uniones de brecha conectan físicamente las células adyacentes y proporcionan una vía para que la corriente eléctrica y las moléculas (<1 KDa) pasen entre las células vecinas^19,20,21. Aunque las células endoteliales expresan las uniones de brecha Cx37, Cx40 y Cx43^19,22, Cx43 es posiblemente la más importante en términos de progresión de la enfermedad^23. La evidencia de la importancia de Cx43 se puede encontrar en el hecho de que la eliminación genética de Cx43 en ratones resulta en hipotensión²⁴ y tiene efectos adversos sobre la angiogénesis²⁵. Además, se ha documentado que Cx43 es importante para la migración y proliferación celular y para la progresión de la aterosclerosis^{18,22,23,24,25} .

En este protocolo, utilizamos TFM y MSM para investigar si la tracción y la generación de tensión intercelular dentro del confluente, monocapa endotelial se vería afectada por la interrupción de la unión de brecha endotelial Cx43. Interrumpimos Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molécula documentada para inhibir cx43 expresión²⁶. Chalcone se utilizó para interrumpir Cx43 en lugar de siRNA como chalcone ha sido reportado previamente por Lee y otros para interrumpir la expresión²⁶de Cx43. Además, estábamos particularmente interesados en la influencia de chalcone en el endotelio, ya que también se ha informado de que es un compuesto antiinflamatorio y antiplaquetario que potencialmente se puede utilizar para la prevención y el tratamiento de varios vasculares patologías²⁶. Los tratamientos de Chalcone se realizaron una hora después del inicio del experimento, se tomaron imágenes monocapas tratadas con chalcone durante un total de seis horas, y el procesamiento de imágenes se realizó con un código MATLAB escrito a medida para determinar las tracciones y, posteriormente, intercelulares Tensiones. Nuestros resultados mostraron una disminución general en las tracciones y tensiones intercelulares, lo que sugiere que Cx43 desempeña un papel clave en la biomecánica endotelial.