Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

O campo que se refere ao estudo dos efeitos das forças físicas e das propriedades mecânicas na fisiologia e patologia celular e tecidual é conhecido como mecanobiologia¹. Algumas técnicas úteis que têm sido utilizadas na mecanobiologia são A microscopia de estresse monocamada e A microscopia de força de tração. A microscopia da força da tração permite a computação dos trações gerados na relação da pilha-carcaça, quando a microscopia de esforço do monocamada permitir a computação de tensões intercelular geradas entre pilhas adjacentes dentro de um monocamada^{2 ,3,4,5,6}. Os resultados obtidos a partir de métodos anteriores sugeriram que as tensões mecânicas derivadas de células desempenham um papel crucial na determinação do destino de uma série de processos celulares^3,4,5. Por exemplo, após a exposição a uma força mecânica externa, um grupo de células migrando como um coletivo pode alterar sua morfologia e polarizar sua forma de alinhar e migrar ao longo da direção da força aplicada, em parte, gerando tracções^7, a ⁸. As tracções fornecem uma métrica que pode ser usada para avaliar a contratilidade celular e são calculadas usando a microscopia de força de tração (TFM). A microscopia de força de tração (TFM) começa com a determinação de deformações de substrato induzidas por células seguidas pelo cálculo do campo de tração usando uma abordagem computacional matematicamente rigorosa e baseada em mecânica. Uma vez que a capacidade de calcular trações tem sido em torno de algum tempo, os pesquisadores têm utilizado TFM para revelar as tracções de impacto têm em uma série de processos, incluindo o câncer⁹, cicatrização de feridas¹⁰ e avaliação de engenharia cardíaca tecido¹¹.

A implementação de TFM e MSM juntos pode ser dividida em três etapas essenciais que devem ser executadas na seguinte ordem: primeiro, as deformações de hidrogel produzidas pelas células são determinadas; segundo, os trações são recuperados das deformações do hidrogel; e em terceiro lugar, uma aproximação do elemento finito é usada para computar tensões intercelular normais e da tesoura dentro da monocamada inteira. Para computar deslocamentos do gel, as imagens do grânulo da fluorescência com pilhas foram comparadas com a imagem do grânulo da referência (sem pilhas) usando uma rotina costume-escrita da Velocimetria da imagem da partícula (PIV). O tamanho da janela de correlação cruzada e a sobreposição para a análise de PIV foram escolhidos para 32 x 32 pixels e 0,5, respectivamente. Neste momento, os deslocamentos de pixel foram convertidos em mícrons multiplicando-se com um fator de conversão de pixel a mícron (para nosso microscópio, esse fator de conversão é 0,65) para obter deslocamentos no plano. Erros associados a ignorar deslocamentos fora do plano são negligenciáveis^12,13. Após a computação de deslocamentos do gel, há dois tipos de medidas da tração que podem ser utilizadas, trações restringidos e trações unrestringidos^8,14. As tracções não restritas fornecem o campo de tração para todo o campo de visão (incluindo regiões com e sem células), enquanto as tracções restritas fornecem o campo de tração somente para regiões que incluem células¹⁴. Em seguida, as tensões intercelulares são calculadas usando a microscopia de estresse monocamada (MSM), que é uma extensão da microscopia de força de tração. A implementação de MSM baseia-se na suposição de que as tracções locais exercidas por uma monocamada de células na interface de substrato celular devem ser equilibradas por forças mecânicas transmitidas entre células na interface célula-célula, conforme exigido pelas leis de Newton^{7 ,12,13}. Uma suposição chave aqui é que o monocamada da pilha pode ser tratado como uma folha elástica fina porque a distribuição da tração no monocamada é sabida e o contrapeso da força não depende das propriedades do material da pilha. Outra suposição fundamental é que as forças de tração são equilibradas por tensões intercelulares locais dentro do campo óptico de visão (dentro da monocamada) e a influência desse equilíbrio de força é mínima na região distal (fora da monocamada)¹³. Portanto, as condições de contorno definidas por tensões intercelulares, deslocamentos ou uma combinação de ambos no limite de monocamada são cruciais para executar MSM¹³. Tendo em conta as informações acima, utilizamos MSM para realizar uma análise de elementos finitos (FEM) para recuperar a tensão principal máxima (σ_máx) e tensão principal mínima (σ_min) girando o plano de tensão em cada ponto dentro do monocamada. Estas tensões principais são usadas subseqüentemente para computar a 2D tensão intercelular normal média [(σ_Max + σ_min)/2] e o esforço intercelular do cisalhamento máximo 2D [(σ_Max -σ_min)/2] dentro da monocamada inteira ^12,13. Este procedimento é descrito com mais detalhes por tambe et al.^12,13

A microscopia de estresse monocamada (MSM) permite o cálculo das tensões intercelulares celulares geradas dentro de uma monocamada^6,7,8,12,13. Essas tensões intercelulares têm sido sugeridas para serem importantes para o crescimento e reparo tecidual, cicatrização de feridas e metástase oncológica^12,15,16,17. Além disso, as tensões intercelulares têm sido sugeridas para também serem importantes na^{migração de células}endoteliais e na função da barreira endotelial^17,18. Quando as junções da pilha-pilha tais como junções apertadas e junções dos aderens tiverem sido sugeridas para jogar um papel crítico na geração e na transmissão intercelular endoteliais do esforço, o papel de junções da abertura permanece indescritível. As junções da abertura conectam fisicamente pilhas adjacentes e fornecem um caminho para a corrente elétrica e as moléculas (< 1 kDa) para passar entre as pilhas vizinhas^19,20,21. Embora as células endoteliais expressem Cx37, Cx40 e Cx43 junções Gap^19,22, Cx43 é indiscutivelmente o mais importante em termos de progressão da doença²³. Evidências de Cx43’s importância podem ser encontradas no fato de que o apagamento genético de Cx43 em camundongos resulta em hipotensão²⁴ e tem efeitos adversos na angiogênese²⁵. Além disso, Cx43 tem sido documentado para ser importante para a migração e proliferação celular e na progressão da aterosclerose^{18,22,23,24,25} .

Neste protocolo, utilizou-se TFM e HSH para investigar se a tração e a geração de estresse intercelular dentro do confluente, monocamada endotelial seriam impactadas pelo rompimento da junção de Gap endotelial Cx43. Nós interrompemos Cx43 com 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), uma molécula documentada para inibir Cx43 expressão²⁶. Chalcona foi usado para interromper Cx43 em vez de siRNA como o Chalcona foi relatado previamente por Lee et al. para interromper Cx43 expressão²⁶. Além disso, estávamos particularmente interessados na influência do chalcone no endotélio, pois também foi relatado como um composto anti-inflamatório e antiplaquetário que pode potencialmente ser usado para a prevenção e tratamento de vários patologias²⁶. Os tratamentos com chalcone foram realizados uma hora após o início do experimento, monocamadas tratados com chalcone foram fotografados por um total de seis horas, e o processamento de imagens foi realizado com um código MATLAB personalizado para determinar tracções e, subsequentemente, intercelular Salienta. Nossos resultados mostraram uma diminuição total em trações e em tensões intercelular, sugerindo que Cx43 Jogue um papel chave na biomecânica endothelial.