Summary

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

Published: October 04, 2019
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Summary

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。

Abstract

内皮細胞は細胞間ストレスやトラクションを生成するために確立されているが、内皮細胞間ストレスおよびトラクション生成におけるギャップ接合が果たす役割は現在知られていない。そこで、我々は、公知のCx43阻害剤2,5−ジヒドロキシカルボン(カルコン)にコンフルエント内皮単層を露出することにより、ギャップ接合コネクシン43(Cx43)が内皮バイオメカニクスに及ぼす影響を調べるための力学ベースのプロトコルを提示する。この阻害剤がトラクションおよび細胞間ストレスに与える影響を測定する。我々は、対照と比較した場合、高いカルコーン投与量(2 μg/mL)の下でトラクションと細胞間ストレスの両方の減少を示す代表的な結果を提示する。このプロトコルは、Cx43だけでなく、適切な阻害剤が使用されると仮定して、他のギャップジャンクションにも適用できます。このプロトコルは、心臓血管およびメカノバイオロジー研究の分野で有用であると考えています。

Introduction

細胞および組織の生理学および病理学に対する物理的な力および機械的特性の影響の研究を指す分野は、メカノバイオロジー1として知られている。メカノバイオロジーで利用されているいくつかの有用な技術は、単層ストレス顕微鏡と牽引力顕微鏡です。トラクション力顕微鏡は、細胞基板界面で生成されたトラクションの計算を可能にする一方、単層応力顕微鏡は、単層2内の隣接する細胞間で発生する細胞間ストレスの計算を可能にする。 ,3,4,5,6.以前の方法から得られた結果は、細胞由来の機械的ストレスが細胞プロセス3、4、5のホストの運命を決定する上で重要な役割を果たしていることを示唆している。例えば、外部の機械的力にさらされると、集団として移動する細胞のグループは、その形態を変更し、その形状を偏光させ、加えた力の方向に沿って整列し、移動することができ、部分的には、牽引を発生させる7、 8.トラクションは、細胞収縮性を評価するために使用できるメトリックを提供し、牽引力顕微鏡(TFM)を使用して計算されます。トラクション力顕微鏡(TFM)は、細胞誘発基板変形の決定から始まり、数学的に厳格な力学ベースの計算アプローチを用いて牽引場の計算を行います。トラクションを計算する能力はかなり長い間あるので、研究者はTFMを利用して、がん9、創傷治癒10、工学的心臓の評価を含む多くのプロセスに対するトラクションの影響を明らかにしました。ティッシュ11.

TFMとMSMの実装は、次の順序で実行する必要がある3つの重要なステップに分けることができます:最初に、細胞によって生成されるヒドロゲル変形が決定されます。第二に、トラクションはヒドロゲル変形から回収されます。第三に、有限要素アプローチは、単層全体の中で正常およびせん断間のストレスを計算するために使用されます。ゲル変位を計算するために、細胞を用いた蛍光ビーズ画像を、カスタム書き込み粒子画像ベロシメトリー(PIV)ルーチンを用いて参照ビーズ画像(細胞なし)と比較した。PIV解析の交差相関ウィンドウサイズとオーバーラップは、それぞれ32 x 32ピクセルと0.5ピクセルに選択されました。このとき、ピクセルシフトを、ピクセルからミクロンへの変換係数を乗算してミクロンに変換し(顕微鏡の場合、この変換係数は0.65)、平面内変位を得た。平面外の変位を無視に関連するエラーは、ごくわずか12,13です。ゲル変位の計算後、利用できるトラクション測定には、拘束されたトラクションと非拘束トラクション8、14の2種類があります。拘束されていないトラクションは、視野全体(セルの有無にかかわらず)のトラクションフィールドを提供し、拘束された牽引はセル14を含む領域に対してのみ牽引フィールドを提供します。次に、細胞間ストレスは、牽引力顕微鏡の延長である単層応力顕微鏡(MSM)を用いて計算される。MSMの実装は、ニュートンの法則7で要求されているように、細胞界面で細胞間で伝達される機械的力によって、細胞の単層によって発揮される局所的な牽引力のバランスをとらなければならないという仮定に基づいている7 1213.ここでの重要な仮定は、単層における牽引分布が知られており、力のバランスが細胞材料特性に依存しないため、セル単層を薄い弾性シートとして扱うことができるということです。もう一つの重要な仮定は、牽引力が光学視野内(単層内)内の局所細胞間応力によってバランスされ、この力バランスの影響は遠位領域(単層の外側)13において最小限である。したがって、細胞間応力、変位、または単層境界における両方の組み合わせによって定義される境界条件は、MSM13を実行するために重要である。上記の情報を考慮して、MSMを使用して有限要素解析(FEM)を実行し、最大主応力(σmax)と最小主応力(σ力)を回復し、単層。これらの主応力は、その後、2D平均法線間間応力[(σmax + σmin)/2]および2D最大せん断間応力[(σmax – σmin)/2]を単層全体で計算するために使用されます。12、13.この手順については、Tambe et al.12,13 によって詳細に説明されています。

単層ストレス顕微鏡(MSM)は、単層6、7、8、12、13内で生成される細胞細胞間ストレスの計算を可能する。これらの細胞間ストレスは、組織の成長および修復、創傷治癒、および癌転移12、15、16、17にとって重要であることが示唆されている。また、細胞間ストレスは、内皮細胞移動および内皮バリア機能17,18においても重要であることが示唆されている。タイトジャンクションや接着接合部などの細胞間接合部は、細胞間ストレスの生成と伝達において重要な役割を果たすることが示唆されているが、ギャップ接合部の役割は依然として不明である。ギャップ接合部は、隣接する細胞を物理的に接続し、隣接する細胞19、20、21の間を通過する電流および分子(<1 KDa)の経路を提供する。内皮細胞はCx37、Cx40、およびCx43ギャップ接合部19、22、Cx43を発現するが、間違いなく疾患進行23の点で最も重要である。Cx43の重要性の証拠は、マウスにおけるCx43の遺伝的欠失が低血圧24を生じ、血管新生25に悪影響を及ぼすという事実で見出されうる。さらに、Cx43は、細胞の移動および増殖およびアテローム性動脈硬化症の進行において重要であることが文書化されている18、22、23、24、25.

このプロトコルでは、TFMとMSMを用いて、コンフルエント内のトラクションおよび細胞間ストレス発生が、内皮単層が内皮ギャップ接合部Cx43の破壊によって影響を受けるかどうかを調べた。我々は、2,5−ジヒドロキシカルゾン(カルコーン)でCx43を破壊し、Cx43発現26を阻害する分子である。カルコーンは、Cx43式26を破壊するために以前にLeeらによって報告されているように、siRNAの代わりにCx43を破壊するために使用された。また、様々な血管の予防と治療に使用できる抗炎症および抗血小板化合物であることが報告されているため、カルコンが内皮に与える影響に特に関心を持っていました。病理26.カルコーン処理は実験開始の1時間後に行い、カルコーン処理単層を合計6時間画像化し、画像処理をカスタム書き込みMATLABコードで行い、トラクションを決定し、その後細胞間を決定した。応力。我々の結果は、トラクションと細胞間ストレスの全体的な減少を示し、Cx43が内皮バイオメカニクスにおいて重要な役割を果たすことを示唆した。

Protocol

1. ポリアクリルアミド(PA)ゲルの製造 ペトリ皿の調製 200 mLの超純水を80μL酢酸と50μLの3-(トリメトキシシル)プロピルメタクリレートと混合して結合シラン溶液を調製する。バインドシランは、ヒドロゲル取り付け用のガラス底ペトリ皿表面を機能させるために使用される溶液である。 少なくとも1時間攪拌プレート上のバインドシラン溶液をかき混ぜます?…

Representative Results

対照の相コントラスト画像は、0.2 μg/mL、および2μg/mLカルコーン処理単層を、カルコーン処理の30分前(図1A-C)およびカルコーン処理後2時間後に撮影した(図1D-F)。細胞誘導ビーズ変位(μm)は、HUVEC単層を対照した場合に低用量カルコーンおよび高用量カルコーン条件の両方で減少することが観察された…

Discussion

我々のグループは、他のグループと同様に、TFMおよびMSMを使用して、インビトロ7、15、18、27における様々な病理学的および生理学的細胞プロセスにおける細胞接合部の影響を調べている。.例えば、Hardinらは、細胞間ストレス伝達が内皮細胞における準細胞間ギャップ形成を示唆する非常に洞察?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、セントラルフロリダ大学のスタートアップファンドと国立心臓、肺、および国立衛生研究所の賞K25HL132098の下で血液研究所によってサポートされました。

Materials

18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

References

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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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