Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.
Abstract
תאי האנדותל הוקמו כדי ליצור מתחים ומלחצים בין-סלולאריים, אך הצמתים הפערים בתפקיד משחקים במתח הבינתאי וביצירת המתיחה כרגע לא ידוע. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לחקור את ההשפעה של הצומת הפער קונשין 43 (Cx43) יש על ביומכניקה אנדותל על ידי חשיפת confluent אנדותל מונולאיירס מCx43 הידוע 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ו מדידת ההשפעה המדכא הזה יש על מדידות ומדגיש התרבות. אנו מציגים תוצאות הנציג, אשר מראים ירידה הן מעקב ומדגיש בין התאים תחת מינון כלקון גבוה (2 μg/mL) בהשוואה לשליטה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק Cx43, אלא גם מצמתי פער אחרים, בהנחה שניתן להשתמש במדכא המתאים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה שימושי בתחומים של מחקר כללי וכלי דם ומכניאוביולוגיה.
Introduction
השדה המתייחס לחקר ההשפעות של הכוחות הפיזיים והתכונות המכאניות של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות הסלולר והרקמה מכונה בביולוגיה מכנית1. מספר טכניקות שימושיות שנוצלו באמצעות מכניאולוגיה הן מיקרוסקופ מתח מונאולייר ומיקרוסקופ כוח גרירה. מיקרוסקופ כוח גרירה מאפשר מיחשוב של מסקות שנוצרו בממשק התא-מצע, בעוד מיקרוסקופ הלחץ דופלקס מאפשר מיחשוב של מתחים בין תאיים שנוצר בין תאים סמוכים בתוך מונאולייר2 ,3,4,5,6 תוצאות הניבו מהשיטות הקודמות הציעו כי מדגיש מכני סלולרי לשחק תפקיד מכריע בקביעת גורלם של שורה של תהליכים סלולריים3,4,5. לדוגמה, בעת חשיפה לכוח מכני חיצוני, קבוצה של תאים העוברים כקולקטיב יכולה לשנות את המבנה שלהם ואת הצורה שלהם כדי ליישר ולהעביר לאורך כיוון הכוח המוחל על ידי, בין השאר, הפקת מעקב7, שמונה. Tractions מספקים מדד שניתן להשתמש בו להערכת כושר התאים ומחושבים באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM). מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm) מתחיל עם הנחישות של המצע המושרה תאים דפורמציות ואחריו את החישוב של שדה המתיחה באמצעות מתמטית קפדנית, מכניקה מבוססי גישה חישובית. מאז היכולת לחשב תיחות כבר סביב די הרבה זמן, החוקרים משתמשים tfm לחשוף את תיחות ההשפעה יש על שורה של תהליכים, כולל סרטן9, פצע ריפוי10 והערכה של הלב מהונדסים . רקמה11
ניתן לחלק את יישום TFM ו-MSM ביחד לשלושה צעדים חיוניים שיש לבצע בסדר הבא: הראשון, הידרוג’ל דפורמציות המיוצרים על ידי התאים נקבעים; שנית, העקבות משוחזרים מתוך דפורמציות הידרוג’ל; ושלישית, גישה לאלמנט סופי משמשת לחישוב מתחים נורמליים ולהטיה בין-תאיים בתוך המונאולייר כולו. כדי לחשב את ג’ל displacements, תמונות הזריחה חרוז עם תאים הושוו עם תמונה חרוז התייחסות (ללא תאים) באמצעות מותאם אישית כתוב חלקיקים התמונה (PIV) השגרה. הקשר בין גודל חלון מתאם חפיפה עבור ניתוח PIV נבחרו להיות 32 x 32 פיקסלים ו 0.5, בהתאמה. בשלב זה, משמרות פיקסל הומרו מיקרון על ידי הכפלת עם מקדם פיקסל מיקרון המרה (עבור המיקרוסקופ שלנו, גורם ההמרה הזה הוא 0.65) כדי להשיג displacements המטוס. שגיאות המשויכות להתעלמות מdisplacements מחוץ למישור הן12,13. לאחר חישוב של ג’ל displacements, ישנם שני סוגים של מדידות המתיחה שיכול להיות מנוצל, הפרשות מוגבלו תיחות בלתימוגבל 8,14. תיחות לא מוגבל לספק את שדה המתיחה עבור השדה כולו של התצוגה (כולל אזורים עם וללא תאים), בעוד תיחות מוגבלת לספק את שדה המתיחה רק עבור אזורים הכוללים תאים14. לאחר מכן, הלחצים הבין-סלולאריים מחושבים באמצעות מיקרוסקופ לחץ מונאולייר (MSM), שהוא הרחבה של מיקרוסקופ כוח המתיחה. יישום ה-MSM מבוסס על ההנחה כי הפרשות המקומיות שהופעלו על ידי מונאולייר של תאים בממשק התא-מצע חייבים להיות מאוזנים על ידי כוחות מכניים ששודרו בין תאים בממשק תא התא כפי שדרש חוקי ניוטון7 ,12,13. ההנחה המפתח כאן היא כי המונרוייר התא יכול להיות מטופל כמו סדין אלסטי דק כי התפלגות המתיחה במונאולייר ידוע ומאזן הכוח אינו תלוי במאפייני חומר התא. ההנחה המפתח הנוסף היא כי כוחות המתיחה מאוזנים על ידי מדגיש בין הסלולר המקומי בתוך השדה האופטי של השקפה (בתוך המונאולייר) ואת ההשפעה של מאזן כוח זה הוא מינימלי באזור המרוחק (מחוץ המונאולייר)13. לכן, תנאי הגבול שהוגדרו על-ידי הלחצים הבינתאיים, הdisplacements, או שילוב של שניהם בגבול המונאולייר הינם חיוניים לביצוע MSM-13. בהתחשב במידע הנ ל, אנו משתמשים ב-MSM כדי לבצע ניתוח אלמנט סופי (פמ) כדי לשחזר את המתח העיקרי המקסימלי (σmax) והלחץ העיקרי מינימלי (σmin) על ידי סיבוב מטוס הלחץ בכל נקודה בתוך ה דופלקס. מדגיש אלה משמשים לאחר מכן כדי לחשב את ממוצע 2d המתח הבין-סלולארי נורמלי [(σmax + σmin)/2] ו-2d להטות מקסימום מתח התרבות [(σmax -σmin)/2] בתוך כל המונאולייר כולו 12,13. הליך זה מתואר ביתר פירוט על-ידי tambe et al.12,13
מיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM) מאפשר חישוב של מדגיש תאי תא בתא שנוצר בתוך מונאולייר6,7,8,12,13. אלה מדגיש התרבות הוצעו להיות חשובים לצמיחה רקמות ותיקון, הפצע ריפוי, סרטן גרורות12,15,16,17. בנוסף, הוצעו מתחים בין-סלולאריים להיות חשובים גם בהעברת תאים אנדותל ובפונקציית המכשול האנדותל17,18. בעוד שצמתים בתאי תא כגון צמתים הדוקים וצמתים מדומה, שניהם הוצעו לשחק תפקיד קריטי ביצירת מתח בין התאים הבינתאיים ושידור, התפקיד של צמתי הפער נשאר חמקמק. הפער בצמתים לחבר את התאים הסמוכים ולספק מסלול עבור זרם חשמלי ומולקולות (ב< 1 kda) לעבור בין תאים שכנים19,20,21. למרות התאים האנדותל אקספרס Cx37, Cx40, ו Cx43 הפער צמתים19,22, Cx43 הוא ללא ספק החשוב ביותר במונחים של התקדמות המחלה23. ראיות של חשיבות Cx43’s ניתן למצוא בעובדה כי מחיקה גנטית של Cx43 בעכברים תוצאות לחץ דם24 ויש לו השפעות שליליות על אנגיוגנזה25. בנוסף, Cx43 תועד להיות חשוב עבור הגירה תא והתפשטות ובהתקדמות של טרשת עורקים18,22,23,24,25 .
בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TFM ו-MSM כדי לחקור אם המתיחה ויצירת הלחץ הבין-תאי בתוך הקשר, היתה מושפעים מהפרעה לצומת הפער האנדותל Cx43. אנחנו שיבשו Cx43 עם 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט), מולקולה מתועדת לעכב Cx43 ביטוי26. Chalcone שימש לשבש Cx43 במקום siRNA כמו chalcone כבר דיווחו בעבר על ידי לי et al. כדי לשבש את ביטוי Cx4326. בנוסף, התעניינו במיוחד בהשפעת הצ על האנדותל כפי שהיא גם דווחה כתרכובת אנטי-דלקתית ואנטי-טסיות שעלולה לשמש למניעה וטיפול בכלי דם שונים פתווגיות26. טיפולים chalcone בוצעו כשעה לאחר הופעת הניסוי, החלב שטופלו monolayers היו תמונות עבור סך של שש שעות, עיבוד תמונה בוצעה עם קוד מותאם אישית כתוב MATLAB כדי לקבוע מעקב ולאחר מכן התרבות דגיש. התוצאות שלנו הראו ירידה כוללת של מתחים והלחצים הבינתאיים, הרומז Cx43 ממלאת תפקיד מרכזי בביומכניקה של האנדותל.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, כבר בהצלחה באמצעות tfm ו MSM כדי לחקור את ההשפעה של צמתים תא תא בתהליכים הסלולריים הפתולוגיים והפיסיולוגיים שונים בתוך מבחנה7,15,18,27 . לדוגמה, הארדין ואח ‘ הציג מחקר תובנה מאוד המציעה מדריכים העברת מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה הסטארט-up ואת הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס K25HL132098.
Materials
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX – 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2′,5′-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
