Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Het veld dat verwijst naar de studie van de effecten van fysieke krachten en van mechanische eigenschappen op cellulaire en weefsel fysiologie en pathologie staat bekend als Mechanobiology¹. Een paar nuttige technieken die zijn gebruikt in de mechanobiologie zijn monolaag stress microscopie en tractiekracht microscopie. Tractiekracht microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van tracties gegenereerd op de celsubstraat interface, terwijl monolaag stress microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van intercellulaire spanningen gegenereerd tussen aangrenzende cellen binnen een monolaag^{2 ,3,4,5,6}. Resultaten opgeleverd uit eerdere methoden hebben gesuggereerd dat cel-afgeleide mechanische spanningen spelen een cruciale rol bij het bepalen van het lot van een groot aantal cellulaire processen^3,4,5. Bijvoorbeeld, bij blootstelling aan een externe mechanische kracht, een groep cellen migreren als een collectief kan hun morfologie veranderen en polariseren hun vorm te uitlijnen en te migreren langs de richting van de toegepaste kracht door, gedeeltelijk, het genereren van tractie^{7, 8}. Tractions bieden een metriek die kan worden gebruikt voor het evalueren van de contractiliteit van de cel en worden berekend met behulp van tractiekracht microscopie (TFM). Tractiekracht microscopie (TFM) begint met de bepaling van celgeïnduceerde substraat vervormingen gevolgd door de berekening van het tractie veld met behulp van een wiskundig rigoureuze, op mechanica gebaseerde computationele benadering. Aangezien de mogelijkheid om te berekenen tractie al geruime tijd is geweest, onderzoekers hebben gebruikt tfm om te onthullen de impact tractie hebben op een groot aantal processen, met inbegrip van kanker⁹, wondgenezing¹⁰ en beoordeling van engineered cardiale weefsel¹¹.

De implementatie van TFM en MSM samen kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen die in de volgende volgorde moeten worden uitgevoerd: ten eerste worden de door de cellen geproduceerde hydrogel vervormingen bepaald; Ten tweede worden tracties teruggewonnen uit hydrogel vervormingen; en ten derde wordt een eindige-element benadering gebruikt om de normale en shear intercellulaire spanningen binnen de gehele monolayer te berekenen. Om gelverplaatsingen te berekenen werden fluorescentie kraal beelden met cellen vergeleken met de referentie kraal afbeelding (zonder cellen) met behulp van een aangepaste-geschreven partikel afbeelding velocimetrie (PIV) routine. De cross-correlatie window grootte en overlapping voor PIV analyse werden gekozen als 32 x 32 pixels en 0,5, respectievelijk. Op dit moment werden pixel verschuivingen omgezet in micron door vermenigvuldiging met een pixel-naar-micron conversiefactor (voor onze Microscoop, deze omrekeningsfactor is 0,65) om in-plane verplaatsingen te verkrijgen. Fouten in verband met het negeren van verplaatsingen buiten het vlak zijn verwaarloosbaar^12,13. Na de berekening van de gelverplaatsingen zijn er twee soorten tractie metingen die kunnen worden gebruikt, beperkte tracties en onbelemmerd tractie^8,14. Onbeperkte tracties bieden het veld tractie voor het hele gezichtsveld (inclusief regio’s met en zonder cellen), terwijl beperkte tractie het tractie veld alleen bieden voor regio’s met cellen¹⁴. Vervolgens worden intercellulaire spanningen berekend met behulp van monolaag stress microscopie (MSM), wat een Verleng deel is van de tractiekracht microscopie. De implementatie van MSM is gebaseerd op de veronderstelling dat lokale tracties die worden uitgeoefend door een monolaag van cellen op de celsubstraat interface moeten worden afgewogen door mechanische krachten die worden overgebracht tussen cellen op de celcelinterface, zoals vereist door de wetten van Newton^{7 ,12,13}. Een belangrijke aanname hier is dat de celmonolayer kan worden behandeld als een dun elastisch blad omdat de tractie verdeling in de monolaag bekend is en de kracht balans niet afhankelijk is van eigenschappen van het celmateriaal. Een andere belangrijke aanname is dat de tractie krachten worden gecompenseerd door lokale intercellulaire spanningen binnen het optische gezichtsveld (binnen de monolayer) en de invloed van deze kracht balans is minimaal in de distale regio (buiten de monolayer)¹³. Daarom zijn de grens omstandigheden die worden gedefinieerd door intercellulaire spanningen, verplaatsingen of een combinatie van beide op de monolaag-grens cruciaal voor het uitvoeren van MSM¹³. Rekening houdend met de bovenstaande informatie gebruiken we MSM om een eindige-elementanalyse (FEM) uit te voeren om de maximale hoofdspanning (σ_Max) en minimale hoofdbelasting (σ_min) te herstellen door het stress vlak op elk punt in de monolaag. Deze belangrijkste spanningen worden vervolgens gebruikt om de gemiddelde normale intercellulaire stress van het 2D te berekenen [(σ_Max + σ_min)/2] en 2D maximale shear intercellulaire stress [(σ_Max -σ_min)/2] binnen de gehele monolaag ^12,13. Deze procedure wordt uitvoeriger beschreven door tambe et al.^12,13

Monolaag stress microscopie (MSM) zorgt voor de berekening van cel-cel intercellulaire spanningen gegenereerd binnen een monolaag^6,7,8,12,13. Deze intercellulaire spanningen zijn gesuggereerd belangrijk voor weefsel groei en herstel, wondgenezing, en kanker metastasen^12,15,16,17. Bovendien, intercellulaire spanningen zijn voorgesteld om ook belangrijk in de endotheliale Celmigratie en endotheliale barrièrefunctie^17,18. Hoewel er beide zijn gesuggereerd om een cruciale rol te spelen in de endotheliale intercellulaire stress generatie en-transmissie, blijft de rol van de kloof knooppunten ongrijpbaar, terwijl de knooppunten van de celcellen, zoals nauwe kruisingen en aanhekings knooppunten, allebei een Gap-knooppunten verbinden fysiek aangrenzende cellen en zorgen voor een pad voor elektrische stroom en moleculen (< 1 kDa) om tussen de naburige cellen^19,20,21te passeren. Hoewel endotheelcellen Express Cx37, Cx40, en Cx43 gap-knooppunten^19,22, Cx43 is aantoonbaar de belangrijkste in termen van ziekteprogressie²³. Bewijs van Cx43’s belang kan worden gevonden in het feit dat genetische deletie van Cx43 in muizen resulteert in hypotensie²⁴ en nadelige effecten heeft op angiogenese²⁵. Daarnaast is Cx43 gedocumenteerd om belangrijk te zijn voor Celmigratie en proliferatie en in de progressie van atherosclerose^{18,22,23,24,25} .

In dit protocol gebruikten we tfm en MSM om te onderzoeken of tractie en intercellulaire stress generatie binnen de confluente, endotheliale monolaag zou worden beïnvloed door de verstoring van de endotheliale gap junction Cx43. We verstoorde Cx43 met 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), een molecuul gedocumenteerd voor de remming van Cx43 expressie²⁶. Chalcon werd gebruikt om Cx43 te verstoren in plaats van siRNA, omdat Chalcon eerder werd gerapporteerd door Lee et al. om Cx43 uitdrukking²⁶te verstoren. Daarnaast waren we vooral geïnteresseerd in de invloed van chalcone op het endotheel omdat het ook is gemeld dat het een anti-inflammatoire en anti-bloedplaatjes verbinding is die mogelijk kan worden gebruikt voor de preventie en behandeling van verschillende vasculaire pathologieën²⁶. Chalcone behandelingen werden uitgevoerd een uur na het begin van het experiment, chalcone-behandelde monolagen werden afbeelding gemaakt voor een totaal van zes uur, en beeldverwerking werd uitgevoerd met een aangepaste geschreven MATLAB code om te bepalen tractie en vervolgens intercellulaire Benadrukt. Onze resultaten toonden een algehele afname van de tractie en intercellulaire spanningen, wat suggereert dat Cx43 een sleutelrol speelt in de endotheliale biomechanica.