نموذج لإصابة الرئة الحادة المحدودة ذاتياً عن طريق الغرس من جانب واحد داخل الشعب الهوائية
Summary
الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية إلى الرئة اليسرى في الفئران يؤدي إلى إصابة حادة حادة أحادية ومحدودة ذاتيا ً التي نماذج متلازمة الضائقة التنفسية الحادة البشرية (ARDS) الناجمة عن شفط حمض المعدة.
Abstract
الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية من حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) إلى القصبات الرئيسية المورين اليسار يسبب إصابة حادة في الأنسجة مع نتائج أمراض الأنسجة مماثلة لمتلازمة الضائقة التنفسية الحادة البشرية (ARDS). الوذمة السنخية الناتجة، وتلف الحاجز الخيفي- الشعري، وتسلل الكريات البيض تؤثر في الغالب على الرئة اليسرى، والحفاظ على الرئة اليمنى كسيطرة غير مصابة والسماح للالحيوانات بالبقاء على قيد الحياة. هذا النموذج من إصابات الرئة الحادة المحدودة ذاتيا تمكن من التحقيق في آليات تحليل الأنسجة، مثل الضامة efferocytosis من العدلات المبرمجة ورد سلامة الحاجز الخيفي الشعري. وقد ساعد هذا النموذج على تحديد الأدوار الهامة لمنبهين القرار، بما في ذلك الوسطاء المتخصصين المؤيدين لحل (SPMs)، وتوفير الأساس لتطوير نهج علاجية جديدة للمرضى الذين يعانون من ARDS.
Introduction
متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) هو سبب مهم لفشل الجهاز التنفسي الحاد1. وهو مرض شائع وقاتل أو معوق يحدث في 10٪ من جميع المرضى الذين أدخلوا إلى وحدات العناية المركزة في جميع أنحاء العالم2. وفقا لتعريف برلين3، يتم تعريف ARDS من قبل بداية حادة من فشل الجهاز التنفسي hypoxemic (<1 أسبوع) والتسلل الرئوي الثنائي على التصوير الإشعاعي للصدر التي لا يفسرها فشل القلب4. يتميز علم الباثوبيولوجيا الكامنة باستجابة التهابية مفرطة. يمكن أن تُصاب الرئة مباشرة، كما هو الحال في الالتهاب الرئوي أو مع شفط حمضالمعدة، أو بشكل غير مباشر، مثل الإنتان أو بعد عمليات نقل الدم المتعددة 4. بعد الإهانة الأولى، يتطور مسببات الأمراض ARDS على ثلاث مراحل: النضحي، التكاثري، والمراحل الليفية1. وتتميز هذه المراحل بآليات متميزة للمناعة والإصلاح الجزيئية والخلوية التي تحدد التكهن لمرضى ARDS. ولا تزال الرعاية الداعمة هي الدعامة الأساسية لمرضى مرضى الـ ARDS؛ حاليا، لا توجد علاجات دوائية فعالة لARDS، لذلك هناك حاجة ملحة لبحث جديد على هذه الحالة المدمرة4.
خلل تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية خلال مرحلة النضحي يساهم في ظهور حاد من ARDS وفشل الجهاز التنفسي المرتبط ة1. وسيط قوي المؤيدة للالتهابات الإشارات ينظم الاستجابات المناعية الأولية، مما يؤدي إلى تعطيل الحاجز الصدغي شعري، وذمة السنخية المنتشرة، وتسلل العدلات إلى موقع إصابة أنسجة الرئة4. في ARDS، إشارات الكبح غير فعالة لالتهاب حاد تستعد لفشل الرئة ويمكن أن تؤخر في الوقت المناسب الكاتاليس من أنسجة الرئة المصابة5. ولهذا الغرض، فإن التحقيق قبل السريريفي في الآليات المحلية للبدء والمؤيدة لحل ARDS قد يكشف عن استراتيجيات علاجية جديدة. ويتطلب هذا التحقيق إجراء تجريبي محدود ذاتياً في نماذج من الإصابات الحادة في الرئة تشبه إلى حد كبير سمات الإصابة البشرية في الرئة، مما يسمح باستجواب الآليات الكامنة وراء مرحلتي البدء والقرار في إصابات الأنسجة.
ينتج نموذج المورين المعروض هنا إصابة رئوية حادة مباشرة توضح العمليات الباثوبيولوجية الأساسية لـ ARDS النضحي، وهي اضطراب الحاجز الخيفي- الشعري وتسلل العدلات. تعتمد هذه الطريقة على الغرس الانتقائي داخل الشعب الهوائية من حمض الهيدروكلوريك من خلال تعليب القصبات الرئيسية اليسرى، وتوطين الإصابة والاستجابة الالتهابية للرئة اليسرى. يمكن استخدام الرئة اليمنى غير المصابة كجهاز تحكم داخلي لتحديد تحديد إصابة الأنسجة والالتهاب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إصابة الرئة من جانب واحد غير مميتة ويكشف عن برنامج قرار. وهذا يوفر نافذة متميزة في حل التهاب الرئة التي يمكن الاستفادة منها لتحديد الوسطاء الذاتيين المؤيدة لحل والآليات الخلوية وفتح سبل علاجية جديدة لARDS التي تؤكد على علم وظائف الأعضاء القرار و الصيدله.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم طريقة الغرس داخل الشعب الهوائية الموصوفة هنا التعليب الانتقائي للقصبات الرئيسية اليسرى لغرس حمض الهيدروكلوريك في الرئة اليسرى، مما أدى إلى إصابة حادة من جانب واحد وحد ذاتي من البول. هذا النموذج إصابة الرئة حمض المورين يمثل عن كثب الاستجابة الالتهابية، علم أمراض الأنسجة، والخلل الفسيولوجي ينظر في ARDS الإنسان، حيث شفط حمض المعدة هو عامل شائع أو مساهم4. التعرض للمجرى الهوائي إلى درجة الحموضة HCl منخفضة يؤدي إلى زيادة نفاذية الحاجز الخيفي الشعيرات الدموية، وذمة السنخية، وتسلل العدلات العميق في موقع الإصابة. لا يتم ملاحظة هذه الأحداث في الرئة اليمنى غير المصابة. وبالإضافة إلى ذلك، ينتج هذا النموذج استجابات التهابية سريعة تبلغ ذروتها في غضون 24 ساعة بعد غرس الحمض، وتشترك في التغيرات في التعبير الجيني مع ARDS الإنسان، مثل التعبير التفاضلي من phospholipase D isoforms10.
على الرغم من أن هذا النموذج ما قبل السريرية murine يستنسخ العديد من ملامح ARDS على المستويات الجزيئية والخلوية والأنسجة، فإنه لا يلخص تماما ARDS الإنسان. ويشمل تعريف ARDS مشاركة الرئة الثنائية3، في حين أن طريقة الغرس الموصوفة هنا النتائج عن طريق التصميم في أمراض الرئة من جانب واحد. وعلاوة على ذلك، فإن الحيوانات لا تتطلب التهوية الميكانيكية المستمرة، والجمود، أو التخدير عن طريق الصالح. النتائج المعروضة هنا (vide أعلاه) وفي أماكن أخرى6و9و11و12و13 تثبت أن إصابات الرئة الناجمة عن حمض من جانب واحد تستنسخ معظم السمات المرضية لل ARDS مع توفير فرصة فريدة لاستخدام الرئة الصحيحة كرقابة داخلية ودراسة مرحلة حل هذا المرض. وعلى هذا النحو، فإن النموذج الذي نوقش هنا نماذج ARDS pathobiology، ولكن أيضا تمكن التحقيق الآلي من الاستجابات أنسجة الرئة الأساسية للإصابة وآليات الحل التي قد تكون ذات صلة لمعالجة هذا المرض المهم.
غرس حمض الهيدروكلوريك يمثل إصابة الرئة الحادة المباشرة، لذلك هو النمذجة جوانب الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة التهاب الرئة الطموح. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء إهانة الرئة اليسرى الأولية في هذا النموذج باستخدام حمض الهيدروكلوريك المعقمة بدلا من محتويات المعدة المحملة بالبكتيريا ينظر إليها في بعض الأحداث الطموح البشري التي يمكن أن تؤدي أيضا إلى الالتهاب الرئوي14. في البشر ، يمكن أن يؤدي طموح البكتيريا المسببة للأمراض إلى الالتهاب الرئوي البكتيري الثانوي الذي يزيد من تفاقم الاستجابة الالتهابية الحادة ، وإطالة فترة إصابة الرئة الأولية وزيادة قابلية المريض لتطوير ARDS14. وقد تم معالجة هذا القيد المحتمل من قبل المحققين عمدا غرس البكتيريا المسببة للأمراض Escherichia coli (E.coli)15 بعد HCl المعقمة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذه الطريقة للتحقيق في مسببات الأمراض بوساطة التهاب. يمكن أن يسبب الالتهاب الرئوي البكتيري من جانب واحد عن طريق غرس الرئة اليسرى انتقائية من البكتيريا، مثل E.القولونية16،17، Pseudomonas aeruginosa16،والعقدية الرئوية 18 . ويمكن أيضا استخدام نموذج إصابة الرئة الحادة المحدودة الذاتي الموصوفة هنا لدراسة إصابات الرئة الناجمة عن التنفس الصناعي (VILI)، وهو سبب هام لزيادة الوفيات في ARDS البشرية19. عادة ما تنطوي النماذج الحيوانية التجريبية من فيلي التهوية الميكانيكية في الفئران السذاجة مع أحجام المد والجزر التي هي أعلى بكثير مما هو يستخدم سريريا للتسبب في إصابة الرئة (> 15 مل / كغ؛ انظر العمل السابق20،21). نحو نموذج أكثر أهمية سريريا من فيلي، يمكن استخدام غرس حمض الشعب الهوائية كما هو موضح هنا أولا للحث على إصابة الرئة غير المميتة تليها التهوية الميكانيكية في أحجام المد والجزر ضمن النطاق السريري (6-12 مل / كغ). هذا النموذج الحيواني الافتراضي قد يسمح للمحققين لدراسة فيلي بطريقة ذات صلة سريريا بمجرد تطويرها والتحقق من صحتها. معا، هذه النماذج مورين تسليط الضوء على براعة طريقة الغرس داخل الشعب الهوائية الانتقائية لتوليد الشتائم الرئة من جانب واحد التي تشبه إلى حد كبير الأمراض المرتبطة بأمراض الرئة البشرية.
بالإضافة إلى السماح بغرس انتقائي لمختلف العوامل الضارة في الرئة اليسرى، فإن تقنية الغرس داخل الشعب الهوائية بعد استئصال القصبة الهوائية لا تتطلب تدريبًا طويلًا، أو وقتًا طويلًا للإجراءات، أو معدات معقدة، وفي أيدي ذوي الخبرة يسبب الحد الأدنى من الضائقة للالحيوانات. على الرغم من ذلك، قد تحدث العديد من المشكلات أثناء إجراء غرس حمض الهيدروكلوريك الانتقائي الذي يمكن أن يؤثر على النتائج التجريبية. يمكن أن يؤدي التعليب غير السليم للقصبات الجذعية الرئيسية اليسرى إلى إصابة الرئة الثنائية التي تقلل من بقاء الفئران التجريبية ويخلط استخدام الرئة اليمنى كتحكم داخلي غير مصاب. ويمكن تجنب ذلك عن طريق صيد القسطرة بما فيه الكفاية نحو الرئة اليسرى أثناء التعليب حتى يتم التوصل إلى المقاومة. بعد حقن حمض الهيدروكلوريك ، يجب حقن بولوس من الهواء ، وإزالة القسطرة بسرعة ، والمجلس الجراحي جلبت تستقيم إلى زاوية 60 درجة. هذه الخطوات حاسمة لضمان وصول الحمض إلى المسالك الهوائية البعيدة للرئة اليسرى ويمنع ارتجاع الحمض في الرئة اليمنى والقصبة الهوائية، والتي قد تسبب إصابة القريبة. في غضون 24 ساعة بعد الغرس، تنتشر الإصابة في الرئة اليسرى مع وذمة رئوية واسعة النطاق، مما يؤثر على كل من الرئة اليسرى البعيدة والقريبة.
أثناء طريقة تطوير في بالغ 8-12 أسبوع فئران قديمة, 2.5 [مل/كغ] من [إين-برونش] [هكل] ينتج جوهريّة بعد [سوبفكت] حادّة رئة إصابة; لم تسفر الجرعات المنخفضة من حمض الهيدروكلوريك عن إصابة رئوية قابلة للاستنساخ ومتجانسة. على الرغم من أننا لم يؤدي هذا النموذج في أصغر سنا (على سبيل المثال، 3-6 أسابيع من العمر) أو الفئران الأكبر سنا (على سبيل المثال، 10-14 شهرا من العمر)، ونحن نتوقع أن التعمّد القائم على الوزن من حمض الهيدروكلوريك سيؤدي إلى النمط الظاهري لإصابة الرئة مماثلة لما لوحظ في الفئران القديمة 8-12 الأسبوع. نوصي بأن المحققين titrate جرعات حمض الهيدروكلوريك لتحقيق الدرجة المطلوبة من إصابة الرئة قبل إجراء تجارب مع الفئران في أقصى درجات الوزن.
يوفر إجراء الغرس الحمضي الانتقائي هذا نموذج ًا غير قاتل من المورين من التهاب الأنسجة المعقمة الذي يقلل من الحاجة إلى الرعاية الداعمة، مثل التهوية الميكانيكية. مع البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة من الفئران المصابة، والالتهاب الناجم عن حمض لديه ما يكفي من الوقت لحل الذات. وقد استخدمت مرحلة الحل من هذا النموذج لتحديد الوسطاء الدهون النشطة بيولوجيا الذاتية المنظمة زمنيا، ودعا الوسطاء المتخصصة المؤيدة لحل (SPMs)، مثل lipoxin A4 (LXA4)،maresin 1 (MaR1)، وresolveins6 ،11،12،16. إدارة SPMs الخارجية للفئران المصابة يسرع من حل إصابة الرئة الناجمة عن حمض عن طريق تثبيط الآليات الالتهابية وتعزيز الحفز من أنسجة الرئة المصابة. هذه SPMs تعزيز إزالة وذمة السنخية12، وزيادة efferocytosis من العدلات المبرمجة من قبل الضامة المعين16، وتسريع إعادة الظهارة من المسالك الهوائية والحويصلات الهوائية12 للحد من الأوعية الدموية التسرب ونقص الأنسجة. في نموذج من إصابة الرئة الناجمة عن مسببات الأمراض، 15-epi-resolvein D1 عرضت أيضا الإجراءات المضادة للميكروبات من خلال زيادة الفيغوستيرية البكتيرية عن طريق الضامة وتعزيز إزالة البكتيرية من الرئة المصابة16. التحقيق في هذه الآليات حل الذاتية يوفر نظرة ثاقبة في الاستراتيجيات العلاجية الجديدة المحتملة للمرضى الذين يعانون من ARDS5.
لدراسة أفضل تنظيم spatiotime من آليات القرار، في نماذج تجريبية في الجسم الحي هناك حاجة. يجب أن تتضمن نماذج إصابات الرئة الحادة استجابات التهابية حادة ذات صلة وخلل في الأعضاء مع مشاركة قرار المضيف تعزيز العمليات الجزيئية والخلوية. ويمكن تحديد هذه الآليات كميا باستخدام مؤشرات الاستبانة المعمول بها22. وقد ثبت أن طريقة الغرس الانتقائيداخل الشعب الهوائية لتوليد إصابات حادة من جانب واحد في الرئة مفيدة في هذا الصدد للتحقيق في وسطاء الحل المحلي والمسارات. الدراسات المستقبلية التي تعمق فهمنا لعمليات التسوية النشطة هذه لديها وعد بقيادة الناهضات العلاجية التي تحاكي الإجراءات الحيوية لوسطاء الدهون الذاتية لتعزيز حل الالتهاب والتخفيف من الاعتلال ووفيات مرض الأربيد والأمراض الرئوية الهامة الأخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور جوزيف ميزجرد على إسهاماته في تطوير الطريقة الانتقائية داخل الشعب الهوائية وعلى تعليقاته المفيدة ومراجعته للمخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح P01GM095467 (B.D.L.) وK08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., Jameson, J. L., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison’s Principles of Internal Medicine, 20e. , (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -. E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -. E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -. E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S. Aspiration Pneumonia. New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -. E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
