Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo mecânico da dissociação para isolar ràpida macrófagos do gânglio dorsal da raiz para o fenotipagem e a análise funcional.
Abstract
Há interesses crescentes para estudar as interações moleculares e celulares entre as células imunes e os neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal após lesão do nervo periférico. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos, são conhecidas por responder a uma lesão tecidual por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. A evidência emergente implicou a contribuição de macrófagos dorsais do gânglio da raiz ao desenvolvimento neuropática da dor e ao reparo axonal no contexto de ferimento do nervo. Rapidamente fenotipagem (ou “isolação rápida de”) a resposta de macrófagos dorsais do gânglio da raiz no contexto da lesão de nervo é desejada identificar os fatores neuroimune desconhecidos. Aqui nós demonstramos como nosso laboratório isola ràpida e eficazmente macrófagos dos gânglios da raiz dorsal usando um protocolo mecânico enzima-livre da dissociação. As amostras são mantidas no gelo por toda parte para limitar o stress celular. Este protocolo é muito menos demorado comparado ao protocolo enzimático padrão e foi usado rotineiramente para nossa análise fluorescência-ativada da classificação de pilha.
Introduction
Há agora uma evidência considerável que as pilhas imunes contribuem à dor neuropática que segue a lesão periférica do nervo1,2. Células monocíticas periféricas, incluindo macrófagos maduros, são conhecidas por responder a lesões teciduais e infecção sistêmica por meio de fagocitose, apresentação de antígeno e liberação de citocinas. Paralelamente à ativação de microglia induzida por lesão nervosa no Corno dorsal espinhal, os macrófagos nos gânglios da raiz dorsal (DRG) também se expandem significativamente após a lesão nervosa3,4. Notavelmente, háinteresses crescentes para determinar se os macrófagos contribuem para o desenvolvimento da dor neuropática após lesão nervosa periférica, interagindo com neurônios sensoriais no DRG5,6,7, 8 . º , 9 anos de , 10 de , 11. Além disso, estudos recentes também implicam a contribuição dos macrófagos DRG no reparo axonal após lesão nervosa12,13. Outro estudo sugere ainda que as subpopulações de macrófago (i.e., CD11b+Ly6CHi e CD11b+Ly6CLow/- Cells) podem desempenhar um papel diferente na hipersensibilidade mecânica14. Conseqüentemente, ràpida fenotipagem a resposta de macrófagos de DRG no contexto da lesão do nervo pode ajudar-nos a identificar os fatores neuroimune que contribuem à dor neuropática.
Convencionalmente, o protocolo para isolar macrófagos no DRG envolve múltiplas etapas, incluindo a digestão enzimática15,16. A técnica é muitas vezes demorada e pode ser dispendiosa para experimentos em grande escala. Embora a digestão suave com colagenase tipo II (4 mg/ml) e Dispase tipo II (4,7 mg/ml) por 20 min foi recomendado anteriormente15, é concebível que as células após a exposição a esta enzima são propensos a danos celulares ou morte celular, o que pode levar a baixa Rendimento. Além disso, a diferença na qualidade das enzimas de lote para lote pode impactar ainda mais a eficiência deste processo. Mais importante, os macrófagos expostos à digestão enzimática podem ser estimulados involuntàvelmente e, portanto, podem ser muito diferentes do status in vivo. As alterações podem potencialmente complicar o desfecho do estudo funcional.
Aqui nós descrevemos um protocolo enzima-livre para isolar ràpida macrófagos de DRG em 4 ° c usando a dissociação mecânica. As amostras são mantidas no gelo para limitar o stress celular. Como resultado, nossa abordagem oferece uma vantagem para manter a consistência do isolamento, e as células isoladas são presumivelmente mais saudáveis e menos estimuladas. Nós apresentamos mais a evidência para validar a qualidade das pilhas isoladas com análise fluorescência-ativada do Cell Sorting (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós introduzimos um método novo para enriquecer eficazmente macrófagos isolados do rato DRG. A abordagem convencional para isolar as células imunes do DRG requer digestão enzimática15,16, queagora é substituída por homogeneização mecânica em nosso protocolo para limitar os danos celulares indesejados e aumentar o rendimento. Portanto, o novo protocolo é muito menos demorado. Mais importante, a digestão da enzima pode estimular os macrófagos e a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O estudo foi apoiado por: Fundação para a educação e pesquisa em anestesia (XY); o departamento de anestesia e assistência perioperatória (XY) da UCSF; e 1R01NS100801-01 (GZ). Este estudo foi apoiado em parte pelo laboratório HDFCCC para a análise de células recurso compartilhado recursos através de uma subvenção da NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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