Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama
Summary
Dairesel RT-PCR, nicel RT-PCR, RNA 5 ‘ polyphosphatase-Treatment ve Kuzey Blot ‘u birleştirerek döngüsel bir RT-PCR tabanlı strateji sunuyoruz. Bu protokol dengesiz 5 ‘ trifosfat etkisini en aza indirmek için bir normalleştirme adım içerir, ve ayrımcılık ve, Mısır mitochondrion dengeli birikmiş birincil ve işlenmiş transkriptler haritalama için uygundur.
Abstract
Bitki mitokondri içinde, bazı sabit-devlet transkriptler 5 ‘ trifosfat transkripsiyon başlatma (primer transkript) türetilmiştir, diğerleri içeren ise 5 ‘ monofosfat Post-transcrip, oluşturulan (işlenmiş transkriptler). İki tür transkripti arasında ayrımcılık yapmak için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir ve çoğu 5 ‘ trifosfat varlığı/yokluğunda bağlıdır. Ancak, primer 5 ‘ Termini ‘de trifosfat kararsız, ve iki tür transkriptlerin net bir ayrımcılığı engelliyor. Mısır mitochondrion ‘da stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek ve eşlemek için, CRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphoshpatase tedavisi, nicel RT-PCR (RT-qPCR) ve Kuzey Blot. Bir gelişme olarak, bu strateji dengesiz 5 ‘ trifosfat etkisini en aza indirmek için bir RNA normalleştirme adımı içerir.
Bu protokolde, zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA RNA 5 ‘ poliphosphataz tarafından önceden tedavi edilir, bu da 5 ‘ triphsophate ‘yi monofosfata dönüştürür. Devre sonrası ve ters transkripsiyondan sonra, 5 ‘ poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen Rnas ‘dan türetilen iki cdnas, işlenmiş 5 ‘ uçtan ve 5 ‘ polyphosphataz ‘a duyarsız olan, Mısır 26S olgun rRNA tarafından normalleştirilmiştir. Normalleştirme işleminden sonra, tedavi edilen ve işlenmeyen RNAs ‘dan elde edilen cRT-PCR ve RT-qPCR ürünlerini karşılaştırarak birincil ve işlenen transkriptler ayrımcılık yapmaktadır. Transkripti Termini, cRT-PCR ürünlerinin klonlanması ve sıralanması ile belirlenir ve daha sonra Kuzey Blot tarafından doğrulanır.
Bu stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondrion ‘daki en kararlı durum transkriptleri belirlenmiştir. Bazı mitokondriyal genlerin karmaşık transkripti deseni nedeniyle, birkaç sabit devlet transkriptleri farklılaşmadı ve/veya eşleştirilmedi, ancak Kuzey Blot ‘da tespit edildi. Biz bu stratejinin ayrımcılık ve diğer bitki mitokondri veya plastids sabit devlet transkriptler harita uygun olup olmadığından emin değiliz.
Introduction
Bitki mitokondri, birçok olgun ve habercisi Rnas birden fazla isoformlar olarak birikir ve sabit devlet transkriptler onların 5 ‘ uçları1,2,3farkı dayalı iki gruba bölünebilir, 4‘ ü yapın. Primer transkriptlerin 5 ‘ trifosfat sonu vardır, bu da transkripsiyon başlamasında elde edilir. Buna karşılık, işlenmiş transkriptler Post-transcriptional işleme tarafından oluşturulan 5 ‘ monofosfat var. İki tür transkripti ayrımcılık ve haritalama, arka plandaki moleküler mekanizmaların ortaya çıkarmak için önemlidir.
Plant mitochondrion ‘daki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrım yapmak için dört büyük strateji geliştirilmiştir. İlk strateji mitokondriyal RNAs ‘ı tütün asidi pirofosfataz (TAP) ile ön tedavi etmektir, bu da 5 ‘ trifosfat ‘i monofosoza dönüştüren ve primer transkriptlerin RNA ligaz ile devre altında olmasını sağlar. Musluk tedavisi ve tedavi edilmeyen RNA örneklerinin transkript fazlalıkları daha sonra cDNA bitleri (yarış) veya dairesel RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4hızlı amplifikasyon ile karşılaştırılır. İkinci stratejide, işlenen transkriptler öncelikle Terminator 5 ‘-fosfat bağımlı eksonükleaz (Tex) kullanarak mitokondriyal Rnas ‘dan tükeniyor ve sol primer transkriptler daha sonra primer uzatma Analizi5,6 ile eşleştirilir . Üçüncü strateji Guanil transferase kullanarak birincil transkriptler ön Cap için, ve daha sonra trifosfatla 5 ‘ Termini konumu ile birlikte ribonükleaz veya S1 nükleaz koruma analizi ile primer uzatma tarafından belirlenir7,8 ,9. 5 ‘ trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı olandan farklı, dördüncü strateji içinde vitro transkripsiyon birleştirir, site-yönlendirilmiş mutagenesis, ve primer uzatma Analizi sözde Rehberleri karakterize ve transkripsiyon belirlemek başlatma siteleri8,10,11. Bu stratejileri kullanarak, bitki mitokondri içinde birçok primer ve işlenmiş transkriptler belirlendi.
Ancak, birkaç çalışmada birincil transkriptlerin 5 ‘ trifosfat kararsız olduğunu bildirdi ve kolayca bilinmeyen nedeni2,4,12,13için monofosfat dönüştürülmüştür. Bu sorun, 5 ‘ trifosfat varlığı/yokluğunda bağlı teknikleri kullanarak transkriptler iki tür net bir ayrımcılık engeller ve önceki çabaları sistematik olarak bitki primer ve işlenmiş transkriptler arasında ayrımcılık için Mitochondri2,12başarısız oldu.
Bu protokolde, cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphosphatase tedavisi, RT-qPCR ve Kuzey leke ‘ı, Mısır (Zea mays) mitokondrion (Şekil 1) ‘ de stabil olarak birikmiş primer ve işlenmiş transkriptleri sistematik olarak ayırt etmek için birleştiriyoruz. cRT-PCR RNA molekülü 5 ‘ ve 3 ‘ ekstremite eşzamanlı haritalama sağlar ve genellikle bitkiler2,12,14,15harita transkript Termini adapte edilir. RNA 5 ‘ polyphosphataz, trifosfatlar 5 ‘ Termini ‘den iki fosfatı kaldırabilir ve bu da birincil transkriptlerin RNA ligaz tarafından Self-ligasyon için kullanılabilir olmasını sağlar. Önceki çalışmalar, Mısır ‘da olgun 26S rRNA 5 ‘ Terminus işlenmiş olduğunu gösterdi ve RNA 5 ‘ polyphosphatase1,16duyarsız oldu. Primer 5 ‘ Termini ‘de kararsız trifosfat etkisini en aza indirmek için, 5 ‘ poliphosphataz tedavi edilen ve tedavi edilmeyen RNAs olgun 26S rRNA tarafından normalleştirilmiş, ve birincil ve işlenmiş transkriptler daha sonra karşılaştırarak farklılaşmış iki RNA örneğinden elde edilen cRT-PCR ürünleri. CRT-PCR haritalama ve ayrımcılık sonuçları Kuzey leke ve RT-qPCR tarafından sırasıyla doğrulanır. Son olarak, alternatif astar Kuzey leke ancak cRT-PCR tarafından algılanan Bu transkriptler yükseltmek için kullanılır. Bu cRT-PCR tabanlı stratejiyi kullanarak, Mısır mitokondri en kararlı durum transkriptler ayırt edilmiş ve1eşleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki bir çalışmada, Arabidopsis hücre süspansiyon kültüründen toplam ve mitokondrial Rnas CRT-PCR tarafından mitokondriyal transkript Termini harita için kullanılan ve benzer sonuçlar elde edildi12. Ancak, mitokondriyal transkript Termini ‘nin diğer birçok çalışmada1,2,3,9eşleminde sadece zenginleştirilmiş mitokondriyal RNA kullanılmışt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 31600250, y), bilim ve teknoloji projeleri Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) ve Çin tarımsal araştırma sistemi (Grant Hayır tarafından desteklenmektedir. ARABALAR-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
