Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based
Summary
Nós apresentamos uma estratégia RT-PCR-baseada circular combinando o RT-PCR circular, o RT-PCR quantitativo, o RNA 5 ‘ polyphosphatase-Treatment, e o borrão do Norte. Este protocolo inclui um passo de normalização para minimizar a influência do trifosfato 5 ‘ instável, e é adequado para discriminar e mapear as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocódrias de milho.
Abstract
Em mitocôndria de plantas, alguns transcritos de estado estacionário têm 5 ‘ trifosfato derivado do início da transcrição (transcritos primários), enquanto os outros contêm 5 ‘ monofosfato gerado pós-transcripcionalmente (transcrições processadas). Para discriminar entre os dois tipos de transcrições, várias estratégias foram desenvolvidas, e a maioria deles depende da presença/ausência de 5 ‘ trifosfato. No entanto, o trifosfato na primária 5 ‘ Termini é instável, e dificulta uma clara discriminação dos dois tipos de transcrições. Para diferenciar e mapear sistematicamente as transcrições primárias e processadas estavelmente acumuladas em mitocídrias de milho, desenvolvemos uma estratégia circular RT-PCR (cRT-PCR), combinando cRT-PCR, tratamento com polifoshpatase de RNA 5, quantitativo RT-PCR (RT-qPCR), e Northern blot. Como uma melhoria, esta estratégia inclui uma etapa da normalização do RNA para minimizar a influência do triphosphate 5 ‘ instável.
Neste protocolo, o RNA mitochondrial enriquecido é pre-treated pelo RNA 5 ‘ polyphosphatase, que converte 5 ‘ triphsophate ao monofosfato. Após a circularização e a transcrição reversa, os dois cDNAs derivados de 5 ‘ RNAs polifosfatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo milho 26S maduro rRNA, que tem um 5 ‘ final processado e é insensível a 5 ‘ polifosfatase. Após a normalização, as transcrições primárias e processadas são discriminadas comparando-se os produtos cRT-PCR e RT-qPCR obtidos a partir das RNAs tratadas e não tratadas. A transcrição Termini são determinados pela clonagem e sequenciamento dos produtos cRT-PCR e, em seguida, verificados pelo Northern blot.
Ao usar essa estratégia, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram determinados. Devido ao teste padrão complicado do Transcript de alguns genes mitochondrial, alguns transcritos do estacionário-estado não foram diferenciados e/ou mapeados, embora fossem detectados em um borrão do Norte. Não temos certeza se esta estratégia é adequada para discriminar e mapear as transcrições de estado estacionário em outras mitocôndrias de plantas ou em plastids.
Introduction
Nas mitocôndrias de plantas, muitos RNAs maduros e precursores são acumulados como múltiplas isoformas, e as transcrições de estado estacionário podem ser divididas em dois grupos com base na diferença em seus 5 ‘ fins1,2,3, a 4. Os transcritos preliminares têm 5 ‘ extremidades do trifosfato, que são derivadas da iniciação da transcrição. Por outro lado, as transcrições processadas têm 5 ‘ monofosfato gerados pelo processamento pós-transcripcional. A discriminação e o mapeamento dos dois tipos de transcrições são importantes para desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à transcrição e à maturação final do transcrito.
Para distinguir entre as transcrições primárias e processadas em mitocrídrias vegetais, foram desenvolvidas quatro estratégias principais. A primeira estratégia é pré-tratar as RNAs mitocondriais com a pirofosfatase ácida do tabaco (TAP), que converte 5 ‘ trifosfato para monofosfato e permite que as transcrições primárias sejam circularizadas por RNA ligase. As abundâncias de transcrição de amostras de RNA tratadas com TAP e não tratadas são comparadas por amplificação rápida de extremidades de cDNA (raça) ou RT-PCR circular (cRT-PCR)2,3,4. Na segunda estratégia, as transcrições processadas são primeiramente esgotadas de RNAs mitocondriais usando o exterminador de terminação 5 ‘-fosfato-dependente (Tex), e as transcrições primárias deixadas são então mapeadas pela análise de extensão de primer5,6 . A terceira estratégia é a pré-tampão das transcrições primárias utilizando guanil transferase e, em seguida, a posição de trifosodiado 5 ‘ Termini é determinada pela extensão da cartilha, juntamente com ribonuclease ouS1 análise de proteção nuclease 7,8 ,9. Diferente daqueles dependendo da presença/ausência de 5 ‘ trifosfato, a quarta estratégia combina in vitro a transcrição, mutagenesis local-dirigido, e a análise da extensão da primeira demão para caracterizar os promotores putativo e para determinar a transcrição sites de iniciação8,10,11. Usando estas estratégias, muitos transcritos preliminares e processados foram determinados na mitocôndria da planta.
No entanto, vários estudos relataram que o 5 ‘ trifosfato de transcritos primários foram instáveis, e eles foram facilmente convertidos em monofosfato por motivo desconhecido2,4,12,13. Este problema dificulta uma discriminação clara dos dois tipos de transcrições, utilizando técnicas dependendo da presença/ausência de 5 ‘ trifosfato, e os esforços anteriores para discriminar sistematicamente entre as transcrições primárias e processadas em plantas a mitocôndria falhou2,12.
Neste protocolo, nós combinamos cRT-PCR, RNA 5 ‘ tratamento da polifosfatase, RT-qPCR, e o borrão do Norte para distinguir sistematicamente os transcritos preliminares e processados estàvel acumulados no milho (Zea Mays) mitodrion (Figura 1). cRT-PCR permite o mapeamento simultâneo de 5 ‘ e 3 ‘ extremidades de uma molécula de RNA, e geralmente é adaptado para mapear a transcrição Termini nas plantas2,12,14,15. O RNA 5 ‘ polyphosphatase poderia remover dois fosfatos do 5 ‘ Termini trifosodiado, que faz as transcrições preliminares disponíveis para o Self-Ligation pela ligase do RNA. Estudos prévios mostraram que o rRNA maduro de 26S no milho tinha processado 5 ‘ Terminus, e era insensível ao RNA 5 ‘ polyphosphatase1,16. Para minimizar a influência do trifosfato instável em 5 ‘ Termini preliminar, os 5 ‘ RNAs polyphosphatase-tratados e não-tratados são normalizados pelo rRNA 26S maduro, e os transcritos preliminares e processados são diferenciados então comparando o produtos de cRT-PCR obtidos a partir das duas amostras de RNA. Os resultados de mapeamento e discriminação de cRT-PCR são verificados por Northern blot e RT-qPCR, respectivamente. Finalmente, os primers alternativos são usados para amplificar aquelas transcrições detectadas no borrão do Norte mas não pelo cRT-PCR. Usando essa estratégia baseada em cRT-PCR, a maioria dos transcritos de estado estacionário em mitocrídrias de milho foram diferenciadas e mapeadas1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em estudo prévio, foram utilizados RNAs totais e mitocondriais da cultura de suspensão celular de Arabidopsis para mapear a transcrição mitocondrial Termini por CRT-PCR, e resultados semelhantes foram obtidos12. No entanto, apenas o RNA mitocondrial enriquecido foi utilizado para mapear a transcrição mitocondrial Termini em muitos outros estudos1,2,3,9. N?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 31600250, Y.Z.), ciência e projetos de tecnologia da cidade de Guangzhou (subvenção n º 201804020015, H.N.), e do sistema de pesquisa agrícola da China (não conceder. CARROS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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