Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR
Summary
Vi presentiamo una strategia circolare basata su RT-PCR combinando RT-PCR circolare, RT-PCR quantitativo, trattamento polifosculo DI RNA 5 e macchia settentrionale. Questo protocollo include una fase di normalizzazione per ridurre al minimo l’influenza del tripofatore instabile 5′, ed è adatto per discriminare e mappare le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais.
Abstract
Nei mitocondri delle piante, alcune trascrizioni in stato costante hanno 5′ triposfato derivato dall’initiazione della trascrizione (trascrizioni primaria), mentre le altre contengono 5′ monofofafato generato post-transcriptionally (trascrizioni elaborate). Per discriminare tra i due tipi di trascrizioni, sono state sviluppate diverse strategie e la maggior parte di esse dipende dalla presenza/assenza di 7′ triposfato. Tuttavia, il triplofato al termine primario 5′ è instabile, e ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni. Per differenziare e mappare sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mitocondrio di mais, abbiamo sviluppato una strategia circolare basata su RT-PCR (cRT-PCR) combinando cRT-PCR, trattamento quantitativo dei polifoshpatasi di RNA 5′, RT-PCR (RT-qPCR) e Northern blot. Come miglioramento, questa strategia include un passo di normalizzazione dell’RNA per ridurre al minimo l’influenza del tripfosfato unstable 5′.
In questo protocollo, l’RNA mitocondriale arricchito è pre-trattato da RNA 5′ polifosforasi, che converte il triphsofato da 5′ in monofagofato. Dopo la circolarizzazione e la trascrizione inversa, i due cDNA derivati da 5′ RNA trattati con polifofofosi e non trattati sono normalizzati dal mais 26S rRNA maturo, che ha una fine elaborata 5′ ed è insensibile a 5′ polifosfolasi. Dopo la normalizzazione, le trascrizioni primarie e trasformate vengono discriminate confrontando i prodotti cRT-PCR e RT-qPCR ottenuti dagli RNA trattati e non trattati. La prova di trascrizione è determinata dalla clonazione e dal sequenziamento dei prodotti cRT-PCR e quindi verificata da Northern blot.
Utilizzando questa strategia, sono state determinate la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais. A causa del complicato schema di trascrizione di alcuni geni mitocondriali, alcune trascrizioni a stato costante non sono state differenziate e/o mappate, anche se sono state rilevate in una macchia settentrionale. Non siamo sicuri se questa strategia sia adatta a discriminare e mappare le trascrizioni dello stato costante in altri mitocondri vegetali o in plastidi.
Introduction
Nei mitocondri vegetali, molti RNA maturi e precursori vengono accumulati come isoformi multipli, e le trascrizioni allo stato costante possono essere divise in due gruppi in base alla differenza alle loro 5 ‘ estremità1,2,3 4. Le trascrizioni primarie hanno 5′ estremità triposphate, che derivano dall’avvio della trascrizione. Al contrario, le trascrizioni elaborate hanno 5′ monofafato generato dall’elaborazione post-trascrizione. La discriminazione e la mappatura dei due tipi di trascrizioni sono importanti per svelare i meccanismi molecolari alla base della trascrizione e della maturazione finale della trascrizione.
Per distinguere tra le trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio vegetale, sono state sviluppate quattro strategie principali. La prima strategia consiste nel pretrattare gli RNA mitocondriali con il pirofosofasi acido del tabacco (TAP), che converte il tripfosfato 5′ in monofagofato e consente alle trascrizioni primarie di essere circolati dalla ligase dell’RNA. L’abbondanza di trascrizioni di campioni di RNA trattati con TAP e non trattati viene quindi confrontata con una rapida amplificazione delle estremità cDNA (RACE) o RT-PCR circolari (cRT-PCR)2,3,4. Nella seconda strategia, le trascrizioni elaborate vengono prima esaurite dagli RNA mitocondriali utilizzando l’eonuclease dipendente dal terminator5-fosfatio (TEX), e le trascrizioni primarie rimaste vengono quindi mappate dall’analisi dell’estensione del primer5,6 . La terza strategia è quella di pre-cap le trascrizioni primarie utilizzando guanylyl transferase, e quindi la posizione di triposphated 5′ è determinata dall’estensione primer insieme con ribonuclease o S1 nuclease protection analysis7,8 ,9. A differenza di quelli che dipendono dalla presenza/assenza di 7′ triposfato, la quarta strategia combina la trascrizione in vitro, la mutagenesi diretta dal sito e l’analisi dell’estensione del primer per caratterizzare i promotori putativi e determinare la trascrizione siti di avvio8,10,11. Utilizzando queste strategie, molte trascrizioni primarie ed elaborate sono state determinate nei mitocondri delle piante.
Tuttavia, diversi studi hanno riferito che il trifosfato 5′ delle trascrizioni primarie erano instabili, e sono stati facilmente convertiti in monofosfato per motivo sconosciuto2,4,12,13. Questo problema ostacola una chiara discriminazione dei due tipi di trascrizioni utilizzando tecniche a seconda della presenza/assenza di trifosfato 5′ e precedenti sforzi per distinguere sistematicamente tra le trascrizioni primarie ed elaborate nell’impianto mitocondri fallito2,12.
In questo protocollo, combiniamo cRT-PCR, trattamento polifosforo RNA 5′, RT-qPCR e macchia settentrionale per distinguere sistematicamente le trascrizioni primarie ed elaborate accumulate stabilmente nel mais (zea mays) mitocondrion (Figura 1). cRT-PCR consente la mappatura simultanea delle estremità 5′ e 3′ di una molecola di RNA, ed è di solito adattata alla trascrizione dei termini nelle piante2,12,14,15. Il polifosforasi di RNA 5′ potrebbe rimuovere due fosfati dal termine di 1’trhafated 5′, il che rende disponibili le trascrizioni primarie per l’auto-legatura da parte della ligase dell’RNA. Studi precedenti hanno dimostrato che il rRNA 26S maturo nel mais aveva elaborato il capolinea 5′, ed era insensibile al polifosculo DI RNA 5 ‘1,16. Per ridurre al minimo l’influenza del triposfato instabile ai termini primari 5′, i 5′ RNA trattati con polifofofofosi e non trattati vengono normalizzati da rRNA 26S maturi, e le trascrizioni primarie ed elaborate vengono quindi differenziate confrontando cRT-PCR ottenuti dai due campioni di RNA. I risultati della mappatura cRT-PCR e della discriminazione sono verificati rispettivamente da Northern blot e RT-qPCR. Infine, i primer alternativi vengono utilizzati per amplificare le trascrizioni rilevate nella macchia settentrionale, ma non da cRT-PCR. Utilizzando questa strategia basata su cRT-PCR, la maggior parte delle trascrizioni a stato costante nel mitocondrio di mais sono state differenziate e mappate1.
Protocol
Representative Results
Discussion
In uno studio precedente, gli RNA totali e mitocondriali della coltura delle sospensioni cellulari dell’Arabidopsis sono stati utilizzati per mappare i termini trascrizione mitocondriale da cRT-PCR, e risultati simili sono stati ottenuti12. Tuttavia, solo l’RNA mitocondriale arricchito è stato utilizzato per mappare la trascrizione mitocondriale termini in molti altri studi1,2,3,<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31600250, Y. , Science and Technology Projects of Guangzhou City (grant n. 201804020015, H.N.) e dal China Agricultural Research System (grant no. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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