דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי
Summary
אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ‘ פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ‘ טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.
Abstract
ב המיטו, כמה תעתיקים של מדינה יציבה יש 5 ‘ טריפוספט נגזר תעתיק שעתוק (התעתיקים העיקריים), בעוד האחרים מכילים 5 ‘ monophosphate שנוצרו לאחר ההמרה (תעתיקים מעובד). כדי להפלות בין שני סוגי התעתיקים, פותחו מספר אסטרטגיות, ורובן תלויות בנוכחות/העדר של 5 טריפוספט. עם זאת, טריפוספט ב 5 ‘ termini העיקרי הוא לא יציב, והיא מעכבת אפליה ברורה של שני סוגים של תעתיקים. כדי להבדיל באופן שיטתי ולמפות את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מספק תירס המיטו, פיתחנו מעגלי RT-PCR (cRT-PCR) מבוססי אסטרטגיה על ידי שילוב cRT-PCR, RNA 5 ‘ פוליפהופטואז טיפול, כמותי הכתם הצפוני (RT-qPCR). כשיפור, אסטרטגיה זו כוללת צעד נורמליזציה של RNA כדי למזער את ההשפעה של 5 ‘ טריפוספט לא יציב.
בפרוטוקול זה, רנ א מיטוכונדריאלי מועשר מטופל מראש על ידי RNA 5 ‘ פוליפהוספטאז, אשר ממיר 5 ‘ triphsophate נאה monophosphate. לאחר שעתוק מעגלי ותמלול הפוכה, שני הcdnas הנגזרים מ-5 ‘ פוליפהוספטאז ‘ והוא לא מטופל, הם מנורמתים על-ידי ממגורות של תירס 26S בוגרת rRNA, שהיא בעלת מעבד 5 מעובד ואינה רגישה לתוך 5 ‘ פוליפהוספטאז. לאחר הנורמליזציה, התעתיקים הראשוניים והמעובדים מפלים בהשוואת מוצרי cRT-PCR ו-RT-qPCR המתקבלים מתוך RNAs המטופל ושאינו מטופל. התמליל נקבע על ידי שיבוט ורצף של מוצרי cRT-PCR, ולאחר מכן מאומת על ידי הכתם הצפוני.
על ידי שימוש באסטרטגיה זו, רוב התעתיקים של המצב היציב ביותר של תירס מיטוכונטרלון נקבעו. בשל דפוס התעתיק המסובך של כמה גנים מיטוכונדריאלי, לא הובחנו ו/או מופו מספר תעתיקים של מצבים יציבים, למרות שזוהו בכתם הצפוני. אנחנו לא בטוחים אם אסטרטגיה זו מתאימה להפלות ולמפות את התעתיקים של המצב היציב במיטוהצמחים או בפלסטלינה.
Introduction
במפעל המיטומטר, rnas רבים מבוגרים ומקודחים נצברים כמו מספר isoforms, ואת התעתיקים של מצב יציב ניתן לחלק לשתי קבוצות מבוסס על ההבדל ב 5 ‘ הקצוות שלהם1,2,3, ד. התעתיקים העיקריים יש 5 ‘ טריפוספט קצוות, אשר נגזר שעתוק חניכה. לעומת זאת, לתעתיקים המעובדים יש 5 ‘ monophosphate שנוצרו על-ידי עיבוד פוסט-טרנססקריפט. אפליה ומיפוי של שני הסוגים של התעתיקים חשובים כדי לפענח את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תעתיק וההבשלה של תעתיק.
כדי להבחין בין התעתיקים העיקריים והמעובדים במפעל המיטומטר, פותחו ארבע אסטרטגיות עיקריות. האסטרטגיה הראשונה היא לטפל מראש עם rnas מיטוכונדריאלי עם חומצת טבק פירופוספאטאז (ברז), אשר ממיר 5 ‘ טריפוספט כדי monophosphate ומאפשר התעתיקים העיקריים להיות מעגלי על ידי RNA ligase. התעתיק מריקודי ה-RNA שטופלו בסטפס ושאינם מטופלים מושווים באמצעות הגברה מהירה של קצוות cdna (מרוץ) או מעגלי RT-pcr (cRT-pcr)2,3,4. באסטרטגיה השנייה, התעתיקים המעובדים הם ראשית לרוקן rnas מיטוכונדריאלי באמצעות שליחות קטלנית 5 ‘-פוספט תלוי-החכירה (TEX), ואת התעתיקים העיקריים שמאל ממופים מכן על ידי פריימר הארכה ניתוח5,6 . האסטרטגיה השלישית היא טרום המכסה את התעתיקים העיקריים באמצעות guanylyl transferase, ולאחר מכן את המיקום של triphosphated 5 ‘ termini נקבע על ידי פריימר הארכה יחד עם ריבונוקלאז או S1 הגנה ההגנה מפני שכירות7,8 ,9. שונה מאלה בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ‘ טריפוספט, האסטרטגיה הרביעית משלבת בתמלול מחוץ למבחנה, מוטזיס מונחה אתרים וניתוח הארכה כדי לאפיין את היזמים ולקבוע את התמלול . מקומות החניכה8,10,11 על-ידי שימוש באסטרטגיות אלה, תעתיקים ראשוניים ומעובדים רבים נקבעו ב המיטו, הצמח.
עם זאת, מספר מחקרים דיווחו כי 5 ‘ הטריפוספט של התעתיקים העיקריים היו יציבים, והם הומרו בקלות monophosphate מסיבה לא ידוע2,4,12,13. בעיה זו מעכבת אפליה ברורה של שני סוגי התעתיקים באמצעות טכניקות בהתאם לנוכחות/היעדרות של 5 ‘ טריפוספט, ומאמצים קודמים להפלות באופן שיטתי בין התעתיקים הראשוניים והמעובדים במפעל מיטוכונמיטוa נכשל2,12.
בפרוטוקול זה, אנו משלבים cRT-PCR, RNA 5 ‘ פוליפהוספטאז הטיפול, RT-qPCR, והצפוני כתם כדי להבדיל באופן שיטתי את התעתיקים העיקרי ומעובד שהצטברו באופן מאוד תירס (Zea מייז) המיטורציה (איור 1). cRT-PCR מאפשר מיפוי סימולטני של 5 ‘ ו-3 ‘ הגפיים של מולקולת RNA, והוא מותאם בדרך כלל למפות את המפה לתוך מפעלים2,12,14,15. רנ א 5 ‘ פוליפהוספטאז יכול להסיר שני פוספטים מן triphosphated 5 ‘ termini, מה שהופך את התעתיקים העיקריים זמין לצורך הפצה עצמית על ידי RNA ligase. מחקרים קודמים הראו כי 26 בוגרים rrna ב תירס עיבד 5 ‘ הטרמינוס, וזה היה חסר רגישות RNA 5 ‘ פוליפהוספטאז1,16. כדי למזער את ההשפעה של טריפוספט יציב בראשית 5 ‘ termini, the 5 ‘ פוליפהוספטאז-טיפל ושאינם מטופלים rnas הם מנורמל על ידי rrna בוגרת, ואת התעתיקים העיקרי ומעובד הם הבדיל מכן על ידי השוואת ה מוצרי cRT-PCR המתקבלים משתי דגימות ה-RNA. המיפוי של ה-cRT-PCR ותוצאות האפליה מאומתים על-ידי הכתם הצפוני ו-RT-qPCR, בהתאמה. בסופו של דבר, משתמשים בצבעי יסוד חלופיים כדי להגביר את התעתיקים שאותרו באבן החשופה בצפון, אך לא באמצעות cRT-PCR. על-ידי שימוש באסטרטגיה זו מבוססת cRT-PCR, התעתיקים הקבועים ביותר במיטוכונטריום בתירס הובלו ומופו1.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר קודם, RNAs הכולל ומיטוכונדריאלי מתרבות ההשעיה של התאים של Arabidopsis שימשו כדי למפות תעתיק מיטוכונדריאלי termini על ידי CRT-PCR, ותוצאות דומות הושגו12. עם זאת, רק RNA מיטוכונדריאלי מועשר שימש למיפוי תעתיק מיטוכונדריאלי טרמיני במחקרים רבים אחרים1,2<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (להעניק no. 31600250, Y.Z.), פרויקטים של מדע וטכנולוגיה של העיר גואנגג’ואו (להעניק no. 201804020015, ח), ואת מערכת המחקר החקלאי סין (להעניק לא. מכוניות-04-PS09, ח).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
