Discrimintion et cartographie des transcriptions primaires et traitées dans la mitochondndrion de maïs à l'aide d'une stratégie circulaire basée sur rt-PCR
Summary
Nous présentons une stratégie circulaire basée sur RT-PCR en combinant la RT-PCR circulaire, la RT-PCR quantitative, le traitement polyphosphatase d’ARN 5′ et la tache nordique. Ce protocole comprend une étape de normalisation pour minimiser l’influence du triphosphate instable de 5′ et il convient de discriminer et de cartographier les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs.
Abstract
Dans les mitochondries végétales, certaines transcriptions à état stable contiennent un triphosphate de 5′ dérivé de l’initiation à la transcription (transcriptions primaires), tandis que les autres contiennent 5′ monophosphate généré sapostolassme post-transcriptionnelle (transcriptions traitées). Pour faire la distinction entre les deux types de transcriptions, plusieurs stratégies ont été élaborées, et la plupart d’entre elles dépendent de la présence ou de l’absence de triphosphate de 5′. Cependant, le triphosphate au termini primaire de 5′ est instable, et il entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions. Pour différencier et cartographier systématiquement les transcriptions primaires et traitées accumulées de façon stable dans la mitochondrie du maïs, nous avons développé une stratégie circulaire basée sur la RT-PCR (cRT-PCR) en combinant cRT-PCR, RNA 5′ traitement polyphoshpatase, quantitatif RT-PCR (RT-qPCR), et Northern blot. À titre d’amélioration, cette stratégie comprend une étape de normalisation de l’ARN pour minimiser l’influence du triphosphate instable de 5′.
Dans ce protocole, l’ARN mitochondrial enrichi est pré-traité par l’ARN 5′ polyphosphatase, qui convertit 5′ triphsophate en monophosphate. Après la circularisation et la transcription inverse, les deux CDNA dérivés de 5′ polyphosphatase-traités et non-traités RNAs sont normalisés par le maïs 26S rRNA mature, qui a une extrémité traitée de 5′ et est insensible à 5′ polyphosphatase. Après normalisation, les transcriptions primaires et traitées sont discriminées en comparant les produits cRT-PCR et RT-qPCR obtenus à partir des ARN traités et non traités. Les termini de transcription sont déterminés par le clonage et le séquençage des produits cRT-PCR, puis vérifiés par la tache nordique.
En utilisant cette stratégie, la plupart des transcriptions à l’état stable dans la mitochondrie du maïs ont été déterminées. En raison du modèle compliqué de transcription de quelques gènes mitochondriques, quelques transcriptions stables-état n’ont pas été différenciées et/ou cartographiées, bien qu’elles aient été détectées dans une tache nordique. Nous ne sommes pas sûrs si cette stratégie est appropriée pour discriminer et cartographier les transcriptions à état stable dans d’autres mitochondries végétales ou dans les plastides.
Introduction
Dans les mitochondries végétales, de nombreux ARN matures et précurseurs sont accumulés sous forme d’isoformes multiples, et les transcriptions à état stable peuvent être divisées en deux groupes en fonction de la différence à leurs 5′ extrémités1,2,3, 4. Les transcriptions primaires ont des extrémités triphosphate de 5′ qui sont dérivées de l’initiation de transcription. En revanche, les transcriptions traitées ont 5′ monophosphate généré par le traitement post-transcriptionnel. La discrimination et la cartographie des deux types de transcriptions sont importantes pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la transcription et à la maturation de fin de transcription.
Pour faire la distinction entre les transcriptions primaires et traitées dans la mitochondrie végétale, quatre stratégies majeures ont été élaborées. La première stratégie consiste à prétraiter les ARN mitochondriaux avec de la pyrophosphatase (TAP) à l’acide du tabac, qui convertit le triphosphate de 5 po en monophosphate et permet de circulariser les transcriptions primaires par la ligase d’ARN. Les abondances de transcription des échantillons d’ARN TAP-traités et non-traités sont alors comparées par l’amplification rapide des extrémités de cDNA (RACE) ou circulaires RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. Dans la deuxième stratégie, les transcriptions traitées sont d’abord épuisées des ARN mitochondriaux à l’aide de l’exonuclease (TEX) de terminator 5′-phosphate-dépendant, et les transcriptions primaires restantes sont ensuite cartographiées par l’analyse d’extension d’amorce5,6 . La troisième stratégie consiste à précaper les transcriptions primaires à l’aide de la gouanylyl transferase, puis la position du termini triphosphated 5′ est déterminée par extension d’amorce avec l’analyse de protection de nucléane de ribonuclease ou de S17,8 ,9. Différente de celles selon la présence/absence du triphosphate de 5′, la quatrième stratégie combine la transcription in vitro, la mutagénèse dirigée par le site, et l’analyse d’extension d’amorce pour caractériser les promoteurs putatifs et déterminer la transcription sites d’initiation8,10,11. En utilisant ces stratégies, de nombreuses transcriptions primaires et traitées ont été déterminées dans les mitochondries végétales.
Cependant, plusieurs études ont rapporté que le triphosphate de 5′ des transcriptions primaires étaient instables, et ils ont été facilement convertis en monophosphate pour la raison inconnue2,4,12,13. Ce problème entrave une discrimination claire des deux types de transcriptions en utilisant des techniques en fonction de la présence/absence de triphosphate de 5′, et les efforts antérieurs pour discriminer systématiquement entre les transcriptions primaires et traitées dans les usines mitochondries a échoué2,12.
Dans ce protocole, nous combinons cRT-PCR, RNA 5′ traitement polyphosphatase, RT-qPCR, et la tache du Nord pour distinguer systématiquement les transcriptions primaires et traitées stablement accumulées dans le maïs (Zea mays) mitochondndrion (Figure 1). cRT-PCR permet la cartographie simultanée des extrémités de 5′ et 3′ d’une molécule d’ARN, et il est généralement adapté pour cartographier les termini de transcription dans les plantes2,12,14,15. La polyphosphatase de l’ARN 5′ pourrait enlever deux phosphates du termini triphosphated 5′, qui rend les transcriptions primaires disponibles pour l’auto-ligaation par ligase d’ARN. Des études antérieures ont montré que l’ARNr 26S mature dans le maïs avait traité le terminus de 5′ et qu’il était insensible à la polyphosphatase1,16. Afin de minimiser l’influence du triphosphate instable au termini primaire de 5′, les ARN de 5′ traités par polyphosphatase et non traités sont normalisés par l’ARNr 26S mature, et les transcriptions primaires et traitées sont ensuite différenciées en comparant le cRT-PCR provenant des deux échantillons d’ARN. Les résultats de la cartographie et de la discrimination cRT-PCR sont vérifiés par Northern blot et RT-qPCR, respectivement. Enfin, d’autres amorces sont utilisées pour amplifier les transcriptions détectées dans Northern blot, mais pas par cRT-PCR. En utilisant cette stratégie basée sur le cRT-PCR, la plupart des transcriptions à état stable dans la mitochondrie du maïs ont été différenciées et cartographiées1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans une étude précédente, les ARN totaux et mitochondriaux de la culture de suspension cellulaire d’Arabidopsis ont été employés pour cartographier le termini mitochondrial de transcription par cRT-PCR, et des résultats semblables ont été obtenus12. Cependant, seulement l’ARN mitochondrial enrichi a été employé pour cartographier le termini de transcription mitochondrial dans beaucoup d’autres études1,2,<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (subvention no 31600250, Y.Z.), les projets scientifiques et technologiques de la ville de Guangzhou (subvention no 201804020015, H.N.), et le China Agricultural Research System (subvention no. CARS-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
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