Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie
Summary
We presenteren een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie door het combineren van circulaire RT-PCR, kwantitatieve RT-PCR, RNA 5 ‘ poly hosphatase-Treatment, en Northern Blot. Dit protocol bevat een normalisatie stap om de invloed van onstabiel 5 ‘ trifosfaat te minimaliseren, en het is geschikt voor het discrimineren en in kaart brengen van de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn verzameld in maïs-mitochondrion.
Abstract
In de mitochondriën van de plant, sommige steady-state transcripten hebben 5 ‘ trifosfaat afgeleid van transcriptie initiatie (primaire transcripten), terwijl de anderen bevatten 5 ‘ monofosfaat gegenereerd post-transcriptioneel (verwerkte transcripties). Om onderscheid te maken tussen de twee soorten transcripties, zijn verschillende strategieën ontwikkeld, en de meeste ervan zijn afhankelijk van aanwezigheid/afwezigheid van 5 ‘ trifosfaat. Echter, het trifosfaat op primaire 5 ‘ Termini is instabiel, en het belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripten. Om de primaire en verwerkte transcripten die stabiel zijn opgebouwd in maïs mitochondrion systematisch te differentiëren en in kaart te krijgen, hebben we een circulaire RT-PCR (cRT-PCR)-gebaseerde strategie ontwikkeld door de combinatie van cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphoshpatase Treatment, kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR) en Northern Blot. Als een verbetering, deze strategie omvat een RNA normalisatie stap om de invloed van unstable 5 ‘ trifosfaat te minimaliseren.
In dit protocol wordt het verrijkte mitochondriale RNA voorbehandeld door RNA 5 ‘ polyphosphatase, dat 5 ‘ triphsophate naar monofosfaat converteert. Na circularisatie en omgekeerde transcriptie worden de twee Cdna’s die zijn afgeleid van 5 ‘ polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna’s genormaliseerd door maïs 26S volwassen rRNA, die een verwerkte 5 ‘ end heeft en ongevoelig is voor 5 ‘ poly fosfatase. Na normalisatie worden de primaire en verwerkte transcripten gediscrimineerd door het vergelijken van cRT-PCR-en RT-qPCR-producten die zijn verkregen uit de behandelde en niet-behandelde Rna’s. Het transcript Termini wordt bepaald door het klonen en sequentiëren van de cRT-PCR-producten, en vervolgens geverifieerd door Northern Blot.
Door deze strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion vastgesteld. Vanwege het gecompliceerde transcript patroon van sommige mitochondriale genen, werden een paar steady-state Transcripten niet gedifferentieerd en/of in kaart gebracht, hoewel ze in een Northern Blot werden aangetroffen. We zijn er niet zeker van of deze strategie geschikt is om de steady-state transcripten in andere mitochondriën van de plant of in plastiden te discrimineren en in kaart te krijgen.
Introduction
In de mitochondriën van de plant, veel volwassen en precursor rna’s worden opgebouwd als meerdere isoforms, en de steady-state transcripten kunnen worden onderverdeeld in twee groepen op basis van het verschil op hun 5 ‘ eindigt1,2,3, 4. De primaire transcripten hebben 5 ‘ trifosfaat uiteinden, die zijn afgeleid van transcriptie initiatie. De verwerkte transcripten daarentegen hebben 5 ‘ monofosfaat gegenereerd door post-transcriptionele verwerking. Discriminatie en mapping van de twee soorten transcripten zijn belangrijk voor het ontrafelen van de moleculaire mechanismen onderliggende transcriptie en transcriptie einde rijping.
Om onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in de mitochondrion van de fabriek, zijn vier belangrijke strategieën ontwikkeld. De eerste strategie is het pre-behandelen van de mitochondriale Rna’s met tabaks zuur pyrofosfatase (TAP), die 5 ‘ trifosfaat naar monofosfaat converteert en maakt het mogelijk primaire transcripten om te worden gecircuariseerd door RNA ligase. De transcriptie van de door tap behandelde en niet-behandelde RNA-monsters wordt vervolgens vergeleken met een snelle versterking van de cDNA-uiteinden (RAS) of de circulaire RT-PCR (cRT-PCR)2,3,4. In de tweede strategie worden verwerkte transcripten in de eerste plaats uitgeput van mitochondriale rna’s met behulp van Terminator 5 ‘-fosfaat-afhankelijke exonuclease (tex), en de primaire transcripten links worden vervolgens in kaart gebracht door de primer extensie analyse5,6 . De derde strategie is de pre-Cap van de primaire transcripten met guanylyl transferase, en dan is de positie van trifosfated 5 ‘ Termini wordt bepaald door primer uitbreiding samen met ribonuclease of S1 Nuclease bescherming analyse7,8 ,9. Verschillend van die afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ‘ trifosfaat, de vierde strategie combineert in vitro transcriptie, site-gerichte mutagenese, en primer extensie analyse om de putende promotors karakteriseren en bepalen de transcriptie initiatie plaatsen8,10,11. Door het gebruik van deze strategieën, veel primaire en verwerkte transcripten zijn vastgesteld in de mitochondriën van de plant.
Echter, verschillende studies hebben gemeld dat de 5 ‘ trifosfaat van primaire transcripten waren instabiel, en ze werden gemakkelijk omgezet in monofosfaat voor onbekendereden2,4,12,13. Dit probleem belemmert een duidelijke discriminatie van de twee soorten transcripties met behulp van technieken, afhankelijk van de aanwezigheid/afwezigheid van 5 ‘ trifosfaat, en eerdere pogingen om systematisch onderscheid te maken tussen de primaire en verwerkte transcripten in plant mitochondriën mislukte2,12.
In dit protocol combineren we cRT-PCR, RNA 5 ‘ polyphosphatase Treatment, RT-qPCR en Northern Blot om systematisch de primaire en verwerkte transcripten te onderscheiden die stabiel zijn opgebouwd in maïs (Zea mays) mitochondrion (Figuur 1). cRT-PCR maakt gelijktijdige mapping mogelijk van 5 ‘ en 3 ‘ extremiteiten van een RNA-molecuul, en het is meestal aangepast aan de map transcript Termini in planten2,12,14,15. RNA 5 ‘ poly fosfatase kan twee fosfaten uit het trifosfaat 5 ‘ Termini verwijderen, waardoor de primaire transcripten beschikbaar zijn voor zelf-ligatie door RNA ligase. Eerdere studies toonden aan dat volwassen 26s rRNA in maïs 5 ‘ eindpunt had verwerkt en ongevoelig was voor RNA 5 ‘ poly fosfatase1,16. Om de invloed van unstable trifosfaat op primaire 5 ‘ Termini te minimaliseren, worden de 5 ‘ polyphosphatase-behandelde en niet-behandelde Rna’s genormaliseerd door volwassen 26s rRNA, en de primaire en verwerkte transcripten worden vervolgens gedifferentieerd door het vergelijken van de cRT-PCR-producten verkregen uit de twee RNA-monsters. De cRT-PCR-mapping en de discriminatie resultaten worden gecontroleerd door respectievelijk Northern Blot en RT-qPCR. Tot slot worden alternatieve primers gebruikt om die transcripten die in Northern Blot zijn gedetecteerd, maar niet door cRT-PCR, te versterken. Door deze cRT-PCR-gebaseerde strategie te gebruiken, zijn de meeste steady-state transcripten in maïs mitochondrion gedifferentieerd en toegewezen1.
Protocol
Representative Results
Discussion
In een eerdere studie werden de totale en mitochondriale Rna’s van celsuspensie cultuur van Arabidopsis gebruikt om de mitochondriale transcriptie Termini door CRT-PCR in kaart te krijgen, en vergelijkbare resultaten werden behaald12. Echter, alleen verrijkt mitochondriaal RNA werd gebruikt voor het in kaart te gaan van de mitochondriale transcript Termini in vele andere studies1,2,3,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation van China (Grant No. 31600250, Y.Z.), Science and Technology Projects van Guangzhou City (Grant No. 201804020015, H.N.) en het China Agricultural Research systeem (Grant No. AUTO’S-04-PS09, H.N.).
Materials
| Acetic acid | Aladdin, China | A112880 | To prepare 1x TAE buffer |
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific, USA | 4359659 | Thermal cycler for PCR amplification |
| Ascorbic acid | Sigma-aldrich, USA | V900134 | For preparation of extraction buffer |
| Biowest Agarose | Biowest, Spain | 9012-36-6 | To resolve PCR products and RNAs |
| Bovine serum albumin | Sigma-aldrich, USA | A1933 | For preparation of extraction buffer |
| Bromophenol blue | Sigma-aldrich, USA | B8026 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis and Northern blot |
| DEPC | Sigma-aldrich, USA | V900882 | Deactivation of RNase |
| DIG Northern starter kit | Roche, USA | 12039672910 | For DIG-RNA labeling and Northern blot. This kit contains the reagents for transcription-labeling of RNA with DIG and T7 RNA polymerase, hybridization and chemiluminescent detection. |
| EDTA | Sigma-aldrich, USA | V900106 | For preparation of extraction buffer and 1x TAE buffer |
| EGTA | Sigma-aldrich, USA | E3889 | For preparation of wash buffer |
| Gel documentation system | Bio-Rad, USA | Gel Doc XR+ | To image the agarose gel |
| Glycerol | Sigma-aldrich, USA | G5516 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
| GoldView II (5000x) | Solarbio,. China | G8142 | DNA staining |
| Hybond-N+, Nylon membrane | Amersham Biosciences, USA | RPN119 | For Northern blot |
| Image Lab | Bio-Rad, USA | Image Lab 3.0 | Image gel, and compare the abundance of PCR products. |
| KH2PO4 | Sigma-aldrich, USA | V900041 | For preparation of extraction buffer |
| KOH | Aladdin, China | P112284 | For preparation of extraction buffer |
| L-cysteine | Sigma-aldrich, USA | V900399 | For preparation of extraction buffer |
| Millex | Millipore, USA | SLHP033RB | To sterile extraction and wash buffers by filtration |
| Miracloth | Calbiochem, USA | 475855-1R | To filter the ground kernel tissues |
| MOPS | Sigma-aldrich, USA | V900306 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, USA | 2000C | For RNA concentration and purity assay |
| NaOH | Sigma-aldrich, USA | V900797 | For preparation of wash buffer |
| pEASY-Blunt simple cloning vector | TransGen Biotech, China | CB111 | Cloning of the gel-recovered band. It contains a T7 promoter several bps upstream of the insertion site. |
| Phanta max super-fidelity DNA polymerase | Vazyme, China | P505 | DNA polymerase for PCR amplification |
| Polyvinylpyrrolidone 40 | Sigma-aldrich, USA | V900008 | For preparation of extraction buffer |
| Primer Premier 6.24 | PREMIER Biosoft, USA | Primer Premier 6.24 | To design primers for reverse transcription and PCR amplification |
| PrimeScript II reverse transcriptase | Takara, Japan | 2690 | To synthesize the first strand cDNA |
| PureLink RNA Mini kit | Thermo Fisher Scientific, USA | 12183025 | For RNA purificaion |
| RNA 5' polyphosphatase | Epicentre, USA | RP8092H | To convert 5' triphosphate to monophosphate |
| RNase inhibitor | New England Biolabs, UK | M0314 | A component of RNA self-ligation and 5' polyphosphatase treatment reactions, and it is used to inhibite the activity of RNase. |
| Sodium acetate | Sigma-aldrich, USA | V900212 | For preparation of running buffer for Northern blot |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich, USA | V900058 | To prepare 20x SSC |
| SsoFas evaGreen supermixes | Bio-Rad, USA | 1725202 | For RT-qPCR |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs, UK | M0437 | For RNA circularization |
| Tetrasodium pyrophosphate | Sigma-aldrich, USA | 221368 | For preparation of extraction buffer |
| TIANgel midi purification kit | Tiangen Biotech, China | DP209 | To purify DNA fragments from agarose gel |
| Tris | Aladdin, China | T110601 | To prepare 1x TAE buffer |
| TRIzol reagent | Invitrogen, USA | 15596026 | To extract mitochondiral RNA. |
| Universal DNA purification kit | Tiangen Biotech, China | DP214 | To recover linearized plastmids from the restriction enzyme digestion reaction |
| Xylene cyanol FF | Sigma-aldrich, USA | X4126 | For preparation of loading buffer for agarose gel electrophoresis |
References
- Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
- Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L. Mapping of wheat mitochondrial mRNA termini and comparison with breakpoints in DNA homology among plants. Plant Molecular Biology. 80 (4-5), 539-552 (2012).
- Calixte, S., Bonen, L. Developmentally-specific transcripts from the ccmFN-rps1 locus in wheat mitochondria. Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 419-426 (2008).
- Kuhn, K., Weihe, A., Borner, T. Multiple promoters are a common feature of mitochondrial genes in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 33 (1), 337-346 (2005).
- Jonietz, C., Forner, J., Holzle, A., Thuss, S., Binder, S. RNA PROCESSING FACTOR2 is required for 5′ end processing of nad9 and cox3 mRNAs in mitochondria of Arabidopsis thaliana. ThePlant Cell. 22 (2), 443-453 (2010).
- Stoll, B., Stoll, K., Steinhilber, J., Jonietz, C., Binder, S. Mitochondrial transcript length polymorphisms are a widespread phenomenon in Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 81 (3), 221-233 (2013).
- Mulligan, R. M., Lau, G. T., Walbot, V. Numerous transcription initiation sites exist for the maize mitochondrial genes for subunit 9 of the ATP synthase and subunit 3 of cytochrome oxidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (21), 7998-8002 (1988).
- Lupold, D. S., Caoile, A. G., Stern, D. B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units. Journal of Biological Chemistry. 274 (6), 3897-3903 (1999).
- Yan, B., Pring, D. R. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Current Genetics. 32 (4), 287-295 (1997).
- Rapp, W. D., Lupold, D. S., Mack, S., Stern, D. B. Architecture of the maize mitochondrial atp1 promoter as determined by linker-scanning and point mutagenesis. Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7232-7238 (1993).
- Rapp, W. D., Stern, D. B. A conserved 11 nucleotide sequence contains an essential promoter element of the maize mitochondrial atp1 gene. The EMBO Journal. 11 (3), 1065-1073 (1992).
- Forner, J., Weber, B., Thuss, S., Wildum, S., Binder, S. Mapping of mitochondrial mRNA termini in Arabidopsis thaliana: t-elements contribute to 5′ and 3′ end formation. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3676-3692 (2007).
- Binder, S., Stoll, K., Stoll, B. Maturation of 5′ ends of plant mitochondrial RNAs. Physiologia Plantarum. 157 (3), 280-288 (2016).
- Hang, R. L., Liu, C. Y., Ahmad, A., Zhang, Y., Lu, F. L., Cao, X. F. Arabidopsis protein arginine methyltransferase 3 is required for ribosome biogenesis by affecting precursor ribosomal RNA processing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16190-16195 (2014).
- Wang, H. Q., et al. Maize Urb2 protein is required for kernel development and vegetative growth by affecting pre-ribosomal RNA processing. New Phytologist. 218 (3), 1233-1246 (2018).
- Maloney, A. P., et al. Identification in maize mitochondrial 26S rRNA of a short 5′-end sequence possibly involved in transcription initiation and processing. Current Genetics. 15 (3), 207-212 (1989).
- Green, R. M., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Canino, G., et al. Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiology. 150 (3), 1494-1502 (2009).
- Gobert, A., et al. A single Arabidopsis organellar protein has RNase P activity. Nature Structural, Molecular Biology. 17, 740-744 (2010).
- Gutmann, B., Gobert, A., Giege, P. PRORP proteins support RNase P activity in both organelles and the nucleus in Arabidopsis. Genes & Development. 26 (10), 1022-1027 (2012).
- Stern, D. B., Goldschmidt-Clermont, M., Hanson, M. R. Chloroplast RNA metabolism. Annual Review of Plant Biology. 61, 125-155 (2010).
