低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ミオシンは、真核生物1、2のアクチン細胞骨格のフィラメントに沿って方向運動を生成するためにアデノシン三リン酸(ATP)を加水分解するメカノケミカルエネルギートランスデューサである。それらは、オルガネラの輸送、筋肉収縮または細胞骨格緊張1、2の生成のような様々な細胞内機能に構造的およびキネチ的に適応している。ミオシンスーパーファミリーは、ヒトゲノム3、4における〜12個の異なるミオシンクラスに属する〜40個のミオシン遺伝子によって表される。ミオシンクラスのメンバーは、いくつかの癌、神経障害、骨格筋症、肥大型心筋症5、6などの非常に多様な疾患のセットで様々な役割を果^たします。これらの分子モータの生理的・病理学的機能が多いため、様々な^条件7の薬剤標的としてますます認知されるようになっているのは驚くべきことではない。最近、新しいミオシン阻害剤8、9、10^および活性化剤11の発見において著しい進歩がなされ、既存のものの特性を改善する12、^{13歳,14歳,15}.

ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)結合ATPaseアッセイは、長い間、サルコプラズマ網状Ca2+ポンプATPase^16、DNA修復ATPase Rad54 17、AAA+ などの様々な酵素のATPase活性を測定するために使用されてきました。ATPase p97¹⁸または微小管モーターキネ^シン19.アッセイはATP再生サイクルを採用しています。ATPaseによって生成されたアデノシン二リン酸(ADP)は、ピルビン酸キナーゼ(PK)によってATPに再生され、1分子のホスホエノールピルビン酸(PEP)を平行にピルビン酸に変換します。続いて、ピルビン酸は乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)によって乳酸に還元される。つまり、NADHの1分子をNADに酸化する。従って、時間の関数としてのNADH濃度の低下はATP加水分解速度に等しい。ATP再生サイクルは、PEP が使用可能である限り、ATP 濃度をほぼ一定に保ち、ADP 濃度を低くします。これは、線形時間コースで、初期反応速度を決定することが容易になり、ADP¹⁹による製品阻害を回避するのに役立ちます。NADH結合ATPaseアッセイは既に96ウェル^{フォーマット20}に適合していますが、反応量が多い(約150μL)ため、試薬の需要が高いため比較的高価であり、多数の高速スクリーニングに対応しにくくなります。化合 物。ATPase酵素によって産生されるリン酸塩の検出に依存するマラカイトグリーンアッセイ19、21などの代替方法は、小型化およびハイスループット^{スクリーニング22}に適っていることが証明された。^,23歳,24.しかし、エンドポイントアッセイは、フルタイムのコースがない場合に未発見のままであるいくつかのアーティファクト(以下で説明)の影響を受ける可能性が高いです。

ここで、NADH結合ATPaseアッセイは、低分子阻害剤の半高スループットスクリーニング用に最適化されている。骨格および心筋ミオシンIIとミオシン阻害剤ブレビスタチン8、パラ-アミノブルビスタ^チン13およびパラ-軽トブルビスタチン12は、NADHに依存するアッセイの力を実証するために使用される読み出しとしての蛍光。このプロトコルは、任意のADP産生酵素に焦点を当てたプロジェクトをスクリーニングするのに適しています。