Изоляция макрофагов и стромальных клеток от миокарда человека и мыши
Summary
Представлен протокол для изоляции различных подмножеств макрофагов и других неиммунных клеток от миокарда человека и мыши путем подготовки одной клеточной подвески через ферментативное пищеварение. Также представлены схемы идентификации цитометрии потока и характеристики изолированных макрофагов.
Abstract
Макрофаги представляют собой наиболее неоднородные и обильные популяции иммунных клеток в сердце и занимают центральное место в воспалении и репаративных реакциях после сердечной травмы. Как различные подмножества макрофагов организовать иммунные реакции после сердечной травмы является активной областью исследований. Представлен простой протокол, который наша лаборатория выполняет регулярно, для извлечения макрофагов из мыши и человеческих образцов миокарда, полученных от здоровых и больных людей. Кратко, этот протокол включает в себя ферментативное пищеварение сердечной ткани для создания одной подвески клеток, а затем окрашивая антитела, и поток цитометрии. Этот метод подходит для функциональных анализов, выполняемых на отсортированных клетках, а также для секвенирования РНК навалом и одноклеточной РНК. Основным преимуществом этого протокола является его простота, минимальная повседневная вариация и широкая применимость, позволяющая исследует неоднородность макрофагов в различных моделях мыши и человеческих заболеваниях.
Introduction
Макрофаги представляют собой наиболее распространенный тип иммунных клеток в сердце, и они играют важную роль в генерации надежных воспалительных и репаративных реакций после сердечной травмы1,2,3,4. Ранее наша группа определила два основных подмножества макрофагов в сердце мурина, полученных из различных происхождения развития5,6. В целом, различные популяции тканей резидентов сердечных макрофагов подмножества могут быть определены на основе экспрессии поверхности клетки CCR2 (C-C мотив хемокин рецептор 2). CCR2– макрофаги (выражение поверхности клетки: CCR2–MHCIIнизкий и CCR2–MHCIIhigh) имеют эмбриональное происхождение (примитивные и эритромиелоидные линии), способные к самообновлению и представляют доминирующую популяцию в гомеостатичных условиях. Резидент CCR2и макрофаги имеют окончательное гематопоиетическое происхождение, поддерживаются путем набора из циркулирующих моноцитов, и представляют незначительную популяцию в гомеостатических условиях. Функционально, CCR2– макрофаги генерировать минимальное воспаление и имеют решающее значение для коронарного развития неонатальной регенерации сердца5,7. В отличие от этого, CCR2и макрофаги инициировать надежные воспалительные реакции после сердечных оскорблений и способствовать залога травмы кардиомиоцитов, неблагоприятное ремоделирование левого желудочка, и сердечная недостаточность прогрессии8,9.
Недавно мы показали, что миокард человека также содержит два различных подмножества макрофагов, идентифицированных аналогичным образом как CCR2– или CCR2No8. Экспрессия генов и функциональный анализ показали, что макрофаги CCR2человека и CCR2 представляют функционально расходящиеся подмножества и функционально аналогичны CCR2– имакрофагам CCR2, найденным в сердце мыши. Человеческий CCR2– макрофаги выражают устойчивые уровни факторов роста, включая IGF1, PDGF, Cyr61 и HB-EGF. Макрофаги CCR2и обогащаются в химокинах и цитокинах, которые способствуют воспалению, таким как IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 и TNF-a. Стимулированные CCR2– макрофаги выделяют заметно более высокие уровни воспалительного цитокина интерлейкина-1 ” (IL-1″) в культуре. Как эти подмножества дифференарно способствуют восстановлению тканей и ремоделирования левого желудочка (LV) в контексте сердечной травмы остается областью активных исследований.
Поток-цитометрия на основе анализа макрофаг неоднородности в мыши и человеческого сердца требует переваривания сердечной ткани и генерации одной клеточной подвески с последующим циклометрическим анализом потока или сортировкой клеток для дальнейших процессов вниз по течению, таких как массовое секвенирование РНК/одноклеточная РНК секвенирования или культивирование клеток для функциональной анализа. Первоначальный протокол для принятия одной ячейки подвески из сердца murine были впервые сообщили nahrendorf группы в Nahrendorf и др. 200710. Наша лаборатория адаптировала и модифицировала протокол для извлечения макрофагов из миокарда человека. Используя тот же протокол, но с небольшимизменением в схеме окрашивания и gating, CD45– стромальные клетки из миокарда человека также могут быть собраны. Представленный здесь, в тексте и видео, протокол, который выполняется регулярно для извлечения макрофагов или стромальный из человеческой миокарда.
Образцы сердечной ткани получают сяритогецы у взрослых пациентов с расширенной кардиомиопатией (DCM: идиопатической или семейной) или ишемической кардиомиопатией (ИКМ), проходящими левожелудочковой вспомогательной помощью (LVAD) имплантации или трансплантации сердца. Выслаженные сердца или сердечники LVAD внутриваскулярно пронизаны холодным сольнием до начала процедуры пищеварения. Важно отметить, что «качество» образца ткани, определяемые с точки зрения степени образования рубцов или инфильтрации жировой ткани, может значительно повлиять на урожайность макрофагов. Образцы сердца с большими областями рубцов будут иметь гораздо более низкую урожайность клеток и могут представлять серьезные технические ограничения, когда желаемые методы анализа вниз по течению требуют культивирования клеток in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол позволяет извлечения различных подмножеств макрофагов из миокарда человека. Протокол прост и занимает от 3 до 4 часов, чтобы подготовить одноклеточную подвеску, готовую к анализу FACS. Хотя протокол относительно прост в исполнении, есть определенные технические аспекты, которые…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект стал возможным благодаря финансированию, предоставленному Детским институтом открытий Вашингтонского университета и Детской больницей Сент-Луиса (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Фондом Барнс-Еврейской больницы (8038-88) и NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. поддерживается NIH K08 HL123519 и Берроуз Добро пожаловать фонда (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
