Isolamento de subconjuntos de macrófagos e células estromais de espécimes miocárdios humanos e de camundongos
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para isolar vários subconjuntos de macrófagos e outras células não imunes do miocátrio humano e do rato, preparando uma única suspensão celular através da digestão enzimática. Também são apresentados esquemas de gating para identificação baseada em citometria de fluxo e caracterização de macrófagos isolados.
Abstract
Macrófagos representam as populações de células imunes mais heterogêneas e abundantes no coração e são centrais na condução de inflamação e respostas reparadoras após lesão cardíaca. Como vários subconjuntos de macrófagos orquestram as respostas imunes após lesão cardíaca é uma área ativa de pesquisa. Apresentado aqui é um protocolo simples que nosso laboratório executa rotineiramente, para a extração de macrófagos de espécimes de miocánio humano e camundongos obtidos de indivíduos saudáveis e doentes. Resumidamente, este protocolo envolve digestão enzimática de tecido cardíaco para gerar uma única suspensão celular, seguido de coloração de anticorpos e citometria de fluxo. Esta técnica é adequada para ensaios funcionais realizados em células classificadas, bem como sequenciamento de RNA em massa e célula única. Uma grande vantagem deste protocolo é a sua simplicidade, variação mínima do dia a dia e ampla aplicabilidade que permite a investigação da heterogeneidade do macrófago em vários modelos de camundongos e entidades de doenças humanas.
Introduction
Os macrófagos representam o tipo de célula imune mais abundante no coração, e desempenham papéis significativos na geração de respostas inflamatórias e reparadoras robustas após lesão cardíaca1,2,3,4. Anteriormente, nosso grupo identificou dois grandes subconjuntos de macrófagos no coração de urina derivados de origens distintas do desenvolvimento5,6. Em termos gerais, populações distintas de subconjuntos de macrófagos cardíacos residentes em tecidos podem ser identificadas com base na expressão da superfície celular do CCR2 (receptor de quimiocina 2 do motivo C-C). CCR2– macrófagos (expressão da superfície celular: CCR2–MHCIIbaixa e CCR2–MHCIIalta)são de origem embrionária (linhagens primitivas e erittroóides), capazes de auto-renovar, e representam uma população dominante em condições homeostáticas. Os CCR2+ macrófagos residentes são de origem hematopoiética definitiva, são mantidos através do recrutamento de monócitos circulantes e representam uma população menor em condições homeostáticas. Funcionalmente, CCR2– macrófagos geram inflamação mínima e são fundamentais para o desenvolvimento coronariano regeneração cardíaca neonatal5,7. Em contraste, CCR2+ macrófagos iniciam respostas inflamatórias robustas após insultos cardíacos e contribuem para a lesão por cardiomiócito colateral, remodelação adversa do ventrículo esquerdo e progressão da insuficiência cardíaca8,9.
Recentemente, mostramos que o miocásio humano também contém dois subconjuntos distintos de macrófagos identificados de forma semelhante como CCR2– ou CCR2+8. A expressão gênica e as análises funcionais revelaram que os CCR2 humanos– e os macrófagos CCR2+ representam subconjuntos funcionalmente divergentes e são funcionalmente análogos à CCR2– e CCR2+ macrófagos encontrados no coração do rato. CCR2 humano– macrófagos expressam níveis robustos de fatores de crescimento, incluindo IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. CCR2+ macrófagos são enriquecidos em quimiocinas e citocinas que promovem inflamação, como IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. Estimulados CCR2+ macrófagos secretam níveis marcadamente mais altos da citocina inflamatória interleucina-1β (IL-1β) na cultura. Como esses subconjuntos contribuem diferencialmente para a reparação de tecidos e a remodelação ventricular esquerda (LV) no contexto da lesão cardíaca continua a ser uma área de pesquisa ativa.
A análise baseada em citometria flow-ofuscar a heterogeneidade do macrófago no camundongo e no coração humano requer digerir o tecido cardíaco e gerar uma única suspensão celular seguida de análise citométrica de fluxo ou classificação celular para processos a jusante, como sequenciamento de RNA em massa/sequenciamento de RNA de célula única ou cultivo das células para ensaios funcionais. O protocolo original para fazer uma única suspensão celular de corações de urina foram relatados pela primeira vez pelo grupo Nahrendorf em Nahrendorf et al. 200710. Nosso laboratório adaptou e modificou o protocolo para extrair macrófagos do miocánio humano. Usando o mesmo protocolo, mas com ligeira modificação no esquema de coloração e gating, CD45– células estromais do miocátrio humano também podem ser colhidas. Apresentado aqui, em texto e vídeo, é um protocolo que é realizado rotineiramente para a extração de macrófagos ou estromal do miocátrio humano.
Espécimes de tecido cardíaco são obtidos de pacientes adultos com cardiomiopatia dilatada (DCM: idiopática ou familiar) ou cardiomiopatia isquêmica (ICM) submetidos à implantação ou transplante cardíaco do dispositivo de assistência ventricular esquerda (LVAD). Os corações explantados ou os núcleos de LVAD são perfundidos intravascular com soro frio antes de começar o procedimento da digestão. É importante notar que a “qualidade” do espécime de tecido determinado em termos de grau de cicatrização ou infiltração de tecido adiposo pode afetar muito o rendimento dos macrófagos. Espécimes cardíacos com grandes áreas de cicatrizes terão rendimento celular muito menor e podem representar séria limitação técnica quando os métodos de análise a jusante desejados requerem cultivo de células in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo permite a extração de vários subconjuntos de macrófagos do miocátrio humano. O protocolo é simples e leva de 3 a 4 horas para preparar a suspensão de célula única pronta para a análise facs. Embora o protocolo seja relativamente simples de executar, há certos aspectos técnicos que precisam ser considerados que minimizarão a variabilidade. Em primeiro lugar, trabalhar em tempo hábil com o tecido humano é necessário para a viabilidade celular ideal. É importante manter o tecido em saline frio /…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi possível graças ao financiamento fornecido pelo Children’s Discovery Institute da Universidade de Washington e pelo St. Louis Children’s Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Fundação do Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e pelo NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. é apoiado pelo NIH K08 HL123519 e burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petridishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
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