שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

1. האדם culturing iPSCs (hiPSCs) על עכבר מעובריים פיברותקיעות (MEF) הערה: שיטות חלופיות עבור culturing hiPSCs יכול לשמש גם, כולל אך לא מוגבל: זריעה על 6 צלחת הבאר מראש עם ג’לטין, תערובת חלבון ז’לטין, רקומביננטי למינציה ב 511, או כל מטריצה אחרת מחפש בשימוש התרחבות היפנוסי, ו תרבותי באמצעות מדיה מוגדר ניסח במיוחד עבור תרבות תא גזע האדם החזק. מתכון לתפירה מעיל תרבות תא 10 ס”מ צלחת פטרי עם 4 מ ל של 0.1% ג’לטין ו דגירה עבור 30 דקות ב 37 ° c. הפשרת בקבוקון של 4 x 106 לקרינה מהירה במהירות לתוך 10 מ ל של 37 ° צ’ מדיה MEF (dma + 10% fbs + 1x פניצילין-סטרפטומיצין + 1X L-גלוטמין תוסף). צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את הגלולה הסלולרית. ב -9 מיל של מדיית התנועה להסיר את הצלחת מצופה ג’לטין מן החממה. הג מרוב ומוסיף 7 מ ל של MEF מדיה. צלחת 3 מ ל של ההשעיה MEF (משלב 1.1.2) על הצלחת מצופה ג’לטין. רוק את התבשיל זה לצד זה ומלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של MEF על הצלחת. מודטה ב 37 ° c עבור 8-36 h. היפרגיול על MEFהערה: הנתונים נוצר באמצעות מארט-1 iPSC נגזר לטווח ארוך מלנומה תרבותית TIL, אשר במיוחד לזהות מארט 1 פפטיד בהקשר של HLA-A * 02:01, כפי שתוארה בעבר18. מעבר hiPSCs כאשר המושבות הן בין 0.8-1.2 מ”מ בקוטר. לפני passaging, בדוק המושבות היפאנט במיקרוסקופ סטריאו ולהסיר כל האזורים של בידול מן התרבות באמצעות קצה הפלסטיק של קצה 200 μL. מנושף מדיה ולהוסיף 10 mL היפנוsc מדיה (האדםהתרבות ES מדיה [טבלה של חומרים] + 10 Ng/ml האדם בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם [hbFGF]) שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב. להחזיק את הצלחת תרבות התא ביד אחת ולגלגל את הכלי תא חד פעמי על פני המנה כולה בכיוון אחד. הפעילו מספיק לחץ כדי שכל להב הרולר ייגע בצלחת התרבות וישמור על לחץ אחיד במהלך פעולת הגלגול. סובב את תבשיל התרבות 90 ° וחזור על שלב 1.2.3. הצג את הצלחת במיקרוסקופ כדי חזותית לאשר חיתוך הנכון של המושבות, אשר אמור להיראות משובץ. ניתוק מושבות לחתוך על ידי שטיפה מכנית עדינה באמצעות 200 μL צנרת.הערה: התנתקות של מושבות לחתוך על ידי שטיפה מכנית חייב להיעשות מיד לאחר חיתוך המושבות עם רולר, כי אחרי 3 דקות מושבות לחתוך יתחיל לחבר את המנה, וזה יהיה קשה לנתק מושבות של גודל הומוגנית על ידי שטיפה. העברה 350-600 גושים של מושבות לחתוך אל המנה החדשה 10 ס מ של MEF (מצופה 8-36 h לפני היפנוסק passaging) עם 10 מ ל של מדיה חדשה היפנוט בתוספת עם 10 μM סלע מעכב. מודטה ב 37 ° c.הערה: 600 גושים מייצג כ 1.0 x 106 מארט -1 ipsc ותניב 0.5-1.0 x 106 תאים DP ביום 35. עם זאת, המספרים הצפויים ישתנו בהתאם לעוצמת קו התאים ותנאי התרבות המתחילים. ביום שלמחרת, מנושף את אמצעי התקשורת ומוסיפים 10 מ ל של מדיית היפנוסק טרייה. לשנות מדיה היפנוsc כל 1-2 ימים בהתאם לקצב הצמיחה היפנוסי. 2. הכנת תאים OP9/DLL1 לשיתוף תרבות עם hiPSCs תרבות OP9/DLL1 תאים ב OP9 מדיה [α-בינוני חיוני מינימלי (α-מזכור) + 20% סרום בפרה העובר (FBS) + 1x פניצילין-סטרפטומיצין] ב 37 ° c. כאשר OP9/DLL1 התאים להגיע שליטה, מחית מדיה ולשטוף פעם אחת עם 5 מ ל של 1x מגנזיום, סידן, ו פנול אדום נטול פוספט באגירה מלוחים (PBS). מחלק את הערוץ ומוסיף 2 מ ל 0.05% טריפסין-EDTA.  דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c. לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל של OP9 מדיה מכנית לנתק את שכבת התא על ידי ליטוף כדי ליצור השעיה תא יחיד. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר כדי למנוע גושי תאים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה מחדש ב -12 מ ל. של OP9 מדיה הוסיפו 8 מ ל של OP9 מדיה לכל אחד מ -6 מנות מהמטבח החדש של התאים פטרי. צלחת 2 מ ל של OP9/DLL1 תא הבולם משלב 2.3 אל כל חדש 10 ס מ צלחת. לנדנד את התבשיל זה לצד זה מלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של OP9/DLL1 על הצלחת. מודטה ב 37 ° c. חזרו על מעבר כל 2-3 ימים כאשר התאים מגיעים לשטף.הערה: חשוב לעשות מספיק מלאי קפוא של OP9/DLL1 תאים ולהפשיר מלאי חדש כל 4-6 שבועות. 3. בבידול חוץ גופית של hiPSCs לתוך CD8αβ+ יחיד חיובי (SP) T תאים הכינו מנות gelatinized OP9/DLL1 שבוע לפני התרבות המשותף עם hiPSCs. כדי להכין 0.1% הפתרון ג’לטין, להוסיף 5 מ ל של טמפרטורת החדר (RT) מלאי רקמות בכיתה פתרון ג’לטין כדי 500 mL של PBS. מעיל 3 חדש 10 ס מ תרבות התא מנות פטרי על ידי הוספת 4 מ ל לכל מנה של 0.1% ג’לטין.  דגירה 30 דקות ב 37 ° c. לאכול ג’לטין ולהוסיף 8 מ ל של OP9 מדיה לכל מנה. מעבר מאכל אחד שוטף של OP9/DLL1 (כפי שנעשה בסעיף 2 לעיל) כדי שלושה מצופים מראש ג’לטין. לאחר 4 ימים, להוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה לכל 10 ס מ צלחת של OP9/DLL1 על ג’לטין, עבור סך של 20 מ ל של מדיה לכל מנה. לאחר 7-8 ימים, התחילו את התרבות הOP9/DLL1 מנות confluent (בידול יום 0). מנושף מדיה מתוך הצלחת 10 ס מ של hiPSCs על MEF. הוסף 10 מ ל של OP9 מדיה. גזור ונתק מושבות היפנוsc באמצעות כלי תא חד פעמי הדרך כפי שנעשה בשלבים 1.2.3 ו 1.2.4. העבר 350-600 גושים של מושבות לחתוך על 10 ס מ pre-gelatinized OP9/DLL1 תבשיל (שלב 3.1) עם 10 מ ל של מדיה חדשה OP9 באמצעות מעבר 200 μL. רוק את התבשיל תרבות מצד לצד ולאחר מכן מלפנים אל גב כדי להבטיח אפילו הפצה של מושבות.הערה: לחילופין, הוקמה מראש הembryoid גופים היפנוסי (בס) או השעיית הגוש הקטן עשוי לשמש.  עם זאת, השימוש בכלי תא חד פעמי או מערכת היווצרות EB מעדיפים לייצר גושים היפנוסים של גודל אחיד. ביום 1, מרוב מדיה בילה ולהחליף עם 20 מ ל של OP9 מדיה טריים. בשנת OP9/DLL1 ליום אחד יופיע מושבות מונאולאר עגולות (איור 1). ביום 5, לאכול 10 מ ל של מדיה בילו ולהוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה טריים. מושבות היאנט יתחילו להבדיל לתוך מזועור פרימיטיבי, המאופיין במרכז כהה רב שכבתי. ביום 9, מוחלק 10 מ ל של מדיה בילו ולהוסיף 10 מ ל של OP9 מדיה טריים. בשלב זה, מבנים מרכז רב שכבתית יתפתחו לצורות כמו כיפה, ואזור היקפי הרשת יתחיל להיות ברור. ביום 13, הקציר המטופאות המטטיים (המחשבים האישיים) (איור 1). היפנוטית-נגזר מבנים ביום 13 מאופיינים על ידי אורגאיד מרכזית כהה מוקף רשת של אזורים כמו כיפה, נציג של אזורי המטפאות (HZs) דיווחו בעבר להקיף את תא גזע האדם העובריים הנגזר ושלתי . עשריםואחדהערה: נוכחותם של מבנים כמו הכיפה מצביעה על תהליך מוצלח גם בהיעדר מרכזים אפלים. חוסר היכולת לייצר HPCs עשוי להיות בשל האיכות הירודה של OP9/DLL1, איכות של FBS הרבה, שליטה של הגושים iPSC הנזרע על OP9/DLL1 (350-600 הגושים הוא אופטימלי), ו/או וריאציות בעוצמה של קווי iPSC כדי לייצר המטפאות precursors. שטפי מדיה בילה ולשטוף 1x עם 5 מ ל של 1x פנול אדום חינם הנקס מאוזנת פתרון מאוזן שונה עם סידן ומגנזיום (HBSS). משף HBSS ולהוסיף 250 μL של 5000 יחידות/mL הקולגן הרביעי ב 10 מ ל של HBSS. מודקון ב 37 ° צ’ צלזיוס עבור 45 דקות. מרוב HBSS עם קולגן הרביעי ולשטוף פעם עם 5 מ ל של PBS. מחלק את הערוץ ומוסיף 5 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA. מודקון ב 37 ° c עבור 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 4 מ ל של OP9 מדיה והנתק את שכבת התא על ידי ליטוף כדי ליצור השעיה תא יחיד. להעביר את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר.  צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את מחדש ב -10 מ ל. של OP9 מדיה תא הצלחת מושעה על gelatinized 10 ס מ החדש החברה לצלחת פטרי (ראה שלבים 3.1.1 ו 3.1.2). מודטה ב 37 ° c עבור 45 דקות. לאחר מכן, לאסוף תאים שאינם מחסיד על ידי ליטוף עדין. העברת השעיית תאים שנאספו לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת תא 100 יקרומטר.  צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. מנושף את סופרנטאנט ומשהה מחדש ב -10 מ ל של בידול מדיה [OP9 media עם 5 ng/ml הגורם האנושי תא הגזע (hscf), 5 ng/ml אדם Flt3 ליגנד (hFLT3L), ו 5 ng/ml האדם אינטרלויקין 7 (היל -7)]. צלחת התא ההשעיה על OP9 חדש 10 ס מ לתוך התבשיל DLL1 שוטפת. . ביום 16, מעבר לתאים ניתוק מכני תאים לא מחסיד על ידי ליטוף עדין ומסנן דרך מסננת תא 100 יקרומטר. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. ומשהה את הסופר-מחדש. בתקשורת בעלת 10 מ ל צלחת התא ההשעיה על OP9 חדש 10 ס מ לתוך התבשיל DLL1 שוטפת. המשך הזדקנות תאים לא מחסיד כל 5-7 ימים לאחר מכן על-ידי צעד חוזר 3.8. ביום 35, העשרת CD4+CD8+ כפול חיובי (DP) האוכלוסייה ולעורר לייצר CD8αβ+ SP T תאים (איור 2). ניתוק מכני תאים לא מחסיד על ידי ליטוף עדין ומסנן דרך מסננת תא 100 יקרומטר כדי להסיר את הגושים תאים. העשרת CD4+ האוכלוסייה תאים על ידי בידוד חרוזים CD4 מגנטי לפי פרוטוקול של היצרן.הערה: הרציונל לשימוש בחרוזים CD4 מגנטיים הוא להסיר תאים CD4-CD8- DN מן התרבות, כמו אלה הוכחו לגרום להרג ישיר של CD4+CD8+ העקורים תאים לאחר גירוי22. הרוזן חי CD4 תאים מועשרים באמצעות הומוציטומטר של ניובאואר ו טריקון צבע כחול.  להשעות OP9 מדיה בריכוז סה כ 0.5 x 106 תאים/mL. מספר 1 mL של ההשעיה התא (0.5 x 106 תאים) לתוך כל טוב של תרבות רקמה תחתונה שטוחה 24 צלחת של CONFLUENT OP9/DLL1. הוסף 100 IU האדם אינטרלויקין 2 (היל -2), 5 ng/ml היל -7, 500 ng/ml אנטי אדם נוגדן CD3, ו 2 μg/ml אנטי אדם נוגדן CD28, אז תרבות ב 37 ° c. ביום 4-7 לאחר הגירוי, לאסוף תאים עבור ניתוח מולקולרי (איור 3) או שיתוף תרבות עם אנטיגן פעמו הצגת תאים (apcs). 4. מדידת אנטיגן ספציפיות של היפנוsc הנגזרת CD8αβ+ SP T תאים הערה: סוג ה-APCs שיש להשתמש בו לצורך ניסיון זה תלוי בהגבלת ה-MHC של תאי T שנגזרו על המסך. כאן, קו התא T2 משמש, שהוא היברידית של קווי תא lymphoblastoid T ו-B. תאים T2 express HLA-A * 02:0123, אשר מזוהה על ידי JKF6 תאים ממנו MART1-ipsc נגזר18. קו תא T2 זה ניתן להרחיב ב-RPMI 1640 + 20% FBS + 1x פניצילין-סטרפטומיצין והוא החוצה כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 5 x 105 תאים/mL. הרוזן חי HLA-A * 02:01+ T-B היברידית lymphoblastoid T2 תאים באמצעות הומוציטוטומיטר neucytom, וצבע כחול של טריבאואר. דגירה APCs ב 24 הטוב התרבות רקמה צלחת עם 1 μg/mL מארט 1 פפטיד עבור 2 h ב 37 ° c.הערה: ריכוז פפטיד אופטימלי הוא משתנה, בהתאם לקו התא וספציפיות אנטיגן. לאסוף APCs ולשטוף 2x עם 10 מ ל של PBS כדי להסיר כל פפטיד נוסף. הרוזן APCs ולהשעות ב 2 – 5 x 105 תאים/ML ב OP9 מדיה עם 100 IU il-2 ו-5 Ng/mL il-7. Aliquot 100 μL של השעיית תא (2-5 x 104 תאים) לתוך כל באר של מצורף אולטרה נמוכה U התחתון 96 הצלחת או ישירות לתוך צלחת מצופה מראש elispot. מיין היפאנט-נגזר CD8αβ+ SP T תאים (שבוע אחרי אנטי אדם CD3/CD28 גירוי הנוגדן) באמצעות סדרן התא להשעות ב 1 x 106 תאים/ml ב OP9 מדיה עם 100 IU IL-2 ו-5 ng/mL IL-7. Aliquot 100 μL של השעיית תא (1 x 105 תאים) לתוך כל באר של apcs ותרבות עבור 16-20 h ב 37 ° c. לאחר 16-20 h, יש לנתח את פרופיל הפרשת הציטוקין על ידי שיטת ELISpot לפי פרוטוקול היצרן (איור 4).