JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

Published: October 24, 2019
doi:
10.3791/59997
, , , , , ,
1Surgery Branch,National Cancer Institute, NIH, 2Center for Cell-Based Therapy,National Cancer Institute, NIH, 3Laboratory of Immunology, Institute for Frontier Life and Medical Sciences,Kyoto University

Summary

Dit artikel beschrijft een methode voor het genereren van functionele tumor antigen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide CD8αβ+ enkele positieve T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem.

Abstract

De opwekking en uitbreiding van functionele T-cellen in vitro kan leiden tot een breed scala aan klinische toepassingen. Een dergelijk gebruik is voor de behandeling van patiënten met gevorderde kanker. Adoptie T Cell Transfer (ACT) van hoog verrijkte tumor antigeen-specifieke T cellen is aangetoond dat het leiden tot duurzame regressie van gemetastaseerde kanker bij sommige patiënten. Echter, tijdens de uitbreiding, deze cellen kunnen worden uitgeput of senescentie, beperking van hun Effector functie en persistentie in vivo. Geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC) kan deze obstakels overwinnen door te leiden tot in vitro generatie van grote aantallen minder gedifferentieerde tumor antigen-specifieke T-cellen. Humaan iPSC (hiPSC) hebben de capaciteit om onderscheid te maken in elk type somatische cel, inclusief lymfocyten, die de oorspronkelijke T Cell receptor (TCR) genomische herschikking behouden wanneer een T-cel wordt gebruikt als een startcel. Daarom, herprogrammering van menselijke tumor antigeen-specifieke T cellen naar hiPSC gevolgd door herdifferentiatie naar T-cel Lineage heeft het potentieel om te produceren verjongd tumor antigeen-specifieke T-cellen. Hier beschreven is een methode voor het genereren van tumor antigen-specifieke CD8αβ+ single positieve (SP) T cellen van hipsc met behulp van OP9/dll1-co-Culture systeem. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor in vitro T cellineage generatie en vergemakkelijkt de ontwikkeling van in vitro afgeleide T cellen voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en cel-gebaseerde therapieën.

Introduction

Naast fysiologische voordelen, T-cellen hebben veel potentiële therapeutische toepassingen. De opwekking en uitbreiding van T-cellen in vitro kan worden gebruikt voor ziekte modellering en therapeutische validering, evenals een bron van behandeling voor erfelijke en verworven immunodeficiëntie toestanden (d.w.z. virale immunodeficiënties en lymfodepletie secundair aan chemotherapie of transplantatie) en voor de uitroeiing van kanker. Deze laatste kwaliteit heeft geleid tot de ontwikkeling van de adoptieve T Cell Transfer (ACT) voor de behandeling van patiënten met gevorderde kanker1.

ACT bestaat uit het resecteren van de tumor van een patiënt, het extraheren van tumor-infiltrerende lymfocyten (TILs), het uitbreiden van TILs ex vivo en het vervolgens reinfgebruiken van de uitgebreide cellen in de patiënt2. Het is aangetoond dat een effectieve behandelings modaliteit voor sommige patiënten met gemetastaseerde kanker.  Helaas, niet alle patiënten reageren op deze therapie. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de differentiatie staat van de overgedragen cellen3,4,5,6,7,8,9, gebruik van grote aantallen van sterk verrijkte kanker antigeen-specifieke T-cellen10, en persistentie van t-cellen na overdracht11,12 zijn allemaal gecorreleerd met duurzamere reacties13,14. Daarom, wanneer ACT niet ontlokken een anti-tumorrespons, het kan deels te wijten zijn aan een lage opbrengst van kanker antigeen-specifieke T cellen, inefficiënte ex vivo expansie leidt tot uitputting en verlies van reactieve klonen, of gebrek aan persistentie na overdracht4 . Er is aangetoond dat deze obstakels kunnen worden overwonnen door het genereren van grote aantallen minder gedifferentieerde kanker antigeen-specifieke T-cellen in vitro15,16.

Hematopoietische stam/voorlopercellen (Hspc’s) zijn een conventionele bron voor in vitro T celgeneratie, hoewel deze methode wordt beperkt door het kleine aantal cellen dat kan worden teruggewonnen uit één donor1. Er is ook aangetoond dat embryonale stamcellen (ESCs) T-cellen produceren, maar met lage opbrengst17, waardoor het inefficiënt is voor klinische toepassingen. Bovendien, aangezien T-Lineage cellen stochastische genetische recombinatie van hun T-cel receptoren (TCRs) in vroege ontwikkelingsstadia ervaren, is het niet mogelijk om Hspc’s of Esc’s te gebruiken om een zuivere populatie van antigeen-specifieke T-cellen te genereren zonder verdere genomische wijzigingen zoals TCR gentransductie.

Een benadering om deze voorbehoud te overwinnen is het herprogrammeren van TILs naar door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), die een onbeperkte bron kunnen bieden voor in vitro T-celgeneratie. Het is aangetoond dat kanker antigeen-specifieke tils kunnen worden geherprogrammeerd in hipscs en opnieuw gedifferentieerd naar t Cell lineage, die dezelfde t Cell receptor (TCR) gen herschikking behoudt als de oorspronkelijke t cel18,19.  Dit detail is belangrijk voor ACT omdat individuele tumoren van de patiënt unieke mutationele profielen hebben, en zeer weinig kanker antigenen is aangetoond te worden gedeeld onder patiënten20. Daarom kan het gebruik van kanker antigeen-specifieke TILs als bron voor in vitro generatie van hiPSC-afgeleide T-cellen een nieuwe strategie bieden voor de gepersonaliseerde behandeling van patiënten met gemetastaseerde kanker.

Hier in detail gepresenteerd is een protocol voor het differentiëren van hiPSC-afgeleide T-Lineage cellen in functionele antigeen-specifieke CD8αβ+ enkelvoudige positieve (SP) T-cellen met behulp van OP9/dll1-co-cultuur systeem. Deze methode is een krachtig hulpmiddel voor in vitro T celdifferentiatie van hiPSCs, hematopoietische voor ouders, en embryonale stamcellen, evenals hun verdere toepassingen in regeneratieve geneeskunde en cel-gebaseerde therapieën.

Protocol

1. culturing menselijke iPSCs (hiPSCs) op de muis embryonale fibroblasten (MEF) Opmerking: Alternatieve methoden voor het kweken van hiPSCs kunnen ook worden gebruikt, inclusief maar niet beperkt tot: zaaien op een 6-goed-plaat voorgecoat met gelatine, een gelatineachtig eiwitmengsel, recombinant laminine 511, of een andere extracellulaire matrix die wordt gebruikt in de hiPSC-expansie, en gekweekt met behulp van gedefinieerde media speciaal geformuleerd voor menselijke pluripotente stamcel cultuur. Culturing MEF Mantel een 10 cm celcultuur Petri schaaltje met 4 mL 0,1% gelatine en inincuberen gedurende 30 min bij 37 °C. Ontdooien een Injectieflacon van 4 x 106 BESTRAALDE MEF snel in 10 ml 37 °C MEF media (DMEM + 10% FBS + 1x penicillaire-streptomycine + 1x L-glutamine supplement). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Zuig de supernatant op en relaat de celpellet in 9 mL MEF-media. Verwijder de gelatine gecoate schaal uit de incubator. Zuig gelatine en voeg 7 mL MEF-media toe. Plaat 3 mL MEF suspensie (vanaf stap 1.1.2) op de Gelatin-gecoate schaal. Rock het gerecht side-to-Side en front-to-back om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van de MEF over het gerecht. Inincuberen bij 37 °C gedurende 8-36 uur. Passaging hiPSC op MEFOpmerking: de gegevens zijn gegenereerd met behulp van Mart-1 IPSC afgeleid van lange termijn gekweekte melanoom til, die specifiek Mart-1 peptide herkent in de context van HLA-A * 02:01, zoals eerder beschreven18. Passage hiPSCs wanneer kolonies tussen 0,8-1,2 mm in diameter. Voorafgaand aan de passage, Controleer de hiPSC-kolonies in een stereomicroscoop en verwijder alle gebieden van differentiatie uit de cultuur met behulp van de kunststof rand van een 200 μL tip. Aspirate verbruikte media en voeg 10 mL hiPSC media (Human ES culture media [tabel van de materialen] + 10 ng/ml humane basis fibroblast groeifactor [hbFGF]) aangevuld met 10 μM rotsremmer. Houd de celcultuurschotel in één hand vast en rol een wegwerp-celpassaging-tool over het hele gerecht in één richting. Pas voldoende druk toe zodat het hele rolblad de cultuur schotel raakt en een gelijkmatige druk behoudt tijdens het rollen. Draai de kweek schaal 90 ° en herhaal stap 1.2.3. Bekijk de plaat in de Microscoop om het juiste snijden van de kolonies visueel te bevestigen, die geblokt moeten verschijnen. Maak de snij kolonies los door voorzichtig mechanisch spoelen met een pipet van 200 μL.Opmerking: Loslating van de snij kolonies door mechanische spoeling moet onmiddellijk worden gedaan na het snijden van kolonies met de roller, omdat na 3 min de gesneden kolonies zullen beginnen te herhechten aan het gerecht, en het zal moeilijk worden om kolonies van homogene grootte te ontkoppelen door blozen. Breng 350-600 klontjes van afgesneden kolonies over op een nieuwe 10 cm schaal van MEF (verguld 8-36 h voorafgaand aan hiPSC passaging) met 10 mL verse hiPSC media aangevuld met 10 μM ROCK remmer. Incuberen bij 37 °C.Opmerking: 600 er klontjes vertegenwoordigt ongeveer 1,0 x 106 Mart-1 IPSC en zal 0,5-1,0 x 106 DP-cellen opleveren op dag 35. Echter, verwachte aantallen zullen variëren afhankelijk van de potentie van de start cellijn en cultuur voorwaarden. De volgende dag, aspiraat verbruikte media en voeg 10 ml van verse hipsc media. Verander hiPSC media elke 1-2 dagen, afhankelijk van de hiPSC-groeisnelheid. 2. bereiding van OP9/DLL1-cellen voor co-cultuur met hiPSCs Cultuur OP9/DLL1-cellen in OP9 media [α-minimaal essentieel medium (α-MEM) + 20% foetaal serum (FBS) + 1x penicilin-streptomycine] bij 37 °C. Wanneer OP9/DLL1-cellen confluency bereiken, aspireren media en wassen één keer met 5 mL 1x magnesium, calcium, en fenolrood-vrije fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). PBS en voeg 2 mL 0,05% trypsine-EDTA toe.  Inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C. Voeg vervolgens 4 mL OP9 media toe en laat de cellaag mechanisch ontkoppelen door pipetteren om een eencellige suspensie te maken. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef van 100 μm om celklonters te voorkomen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant en respenderen in 12 mL van OP9 media. Voeg 8 mL OP9 media toe aan elk van de zes nieuwe 10 cm celkweek Petri schaaltjes. Plaat 2 mL OP9/DLL1-celsuspensie van stap 2,3 op elke nieuwe 10 cm schaal. Rock het gerecht side-to-side dan front-to-back om ervoor te zorgen gelijkmatige verdeling van OP9/DLL1-over het gerecht. Incuberen bij 37 °C. Herhaal de passage elke 2-3 dagen wanneer cellen confluency bereiken.Opmerking: Het is belangrijk om voldoende bevroren voorraad OP9/DLL1-cellen te maken en elke 4-6 weken een nieuwe voorraad te ontdooien. 3. in vitro differentiatie van hiPSCs in CD8αβ+ enkelvoudige positieve (SP) T-cellen Bereid gelatiniseerde OP9/DLL1-gerechten een week voorafgaand aan de co-cultuur met hiPSCs. Om 0,1% gelatine oplossing te bereiden, voeg 5 mL kamertemperatuur (RT) weefsel-grade gelatine oplossing toe aan 500 mL PBS. Coat 3 nieuwe 10 cm celcultuur Petri schaaltjes door toevoeging van 4 mL per schotel van 0,1% gelatine.  Inincuberen 30 min bij 37 °C. Aspirate gelatine en voeg 8 mL OP9 media toe aan elk gerecht. Passage een confluente schotel van OP9/DLL1-(zoals gedaan in sectie 2 hierboven) tot drie gelatine voorgecoate gerechten. Voeg na 4 dagen 10 mL OP9 media toe aan elke 10 cm schaal van OP9/DLL1-op gelatine, voor in totaal 20 mL media per gerecht. Na 7-8 dagen, begin de hiPSC co-Culture op OP9/DLL1-Confluent Health dishes (differentiatie dag 0). Aspirate verbruikte media van Confluent Health 10 cm schotel van hiPSCs op MEF. Voeg 10 mL OP9 media toe. Snijd en ontkoppel hiPSC-kolonies met behulp van een wegwerp-celpassaging tool zoals gedaan in stappen 1.2.3 en 1.2.4. Breng 350-600 klontjes van afgesneden kolonies over op een 10 cm voorgegelatiniseerde OP9/DLL1-schaal (stap 3,1) met 10 mL verse OP9 media met een pipet van 200 μL. Rock de cultuur schotel side-to-side dan front-to-back om te zorgen voor gelijkmatige verdeling van kolonies.Opmerking: u ook vooraf gevormde hipsc embryoid Bodies (EBs) of Small klomp Suspension gebruiken.  Het gebruik van een wegwerp-celpassage of een EB-vormings systeem verdient echter de voorkeur om hipsc-er klontjes van uniforme grootte te produceren. Op dag 1, aspiraat verbruikte media en vervangen door 20 ml van verse OP9 media. hipsc-er klontjes die samen op OP9/dll1-voor 1 dag worden gekweekt, verschijnen als kleine ronde monolaag kolonies (Figuur 1). Op dag 5, aspireren 10 mL verbruikte media en voeg 10 mL verse OP9 media. hiPSC kolonies zullen beginnen te differentiëren in primitieve mesoderm, die wordt gekenmerkt door een meerlaagse donkere centrum. Op dag 9, aspireren 10 mL verbruikte media en voeg 10 mL verse OP9 media. Op dit punt zullen meerlaagse centrum structuren zich ontwikkelen tot koepel achtige vormen, en een perifeer netwerk achtig gebied zal duidelijk beginnen te worden. Op dag 13, oogst hematopoietische voorlopercellen (Hpc’s) (figuur 1). hipsc-afgeleide structuren op dag 13 worden gekenmerkt door een donkere centrale organoïde omgeven door een netwerk van koepel achtige gebieden, representatief voor hematopoietische zones (HZS) eerder gemeld om menselijke embryonale stamcel-afgeleide hematopoietische voorlopercellen te omsluiten 21.Opmerking: de aanwezigheid van de koepel achtige structuren duidt op een succesvol proces, zelfs bij afwezigheid van donkere centra. Het onvermogen om hpc’s te produceren kan te wijten zijn aan slechte kwaliteit van OP9/dll1-, kwaliteit van FBS veel, confluentie van IPSC er klontjes geseede op OP9/dll1-(350-600 klonters is optimaal), en/of variaties in potentie van IPSC lijnen voor de productie van hematopoietische precursoren. Aspirate verbruikte media en was 1x met 5 mL 1x fenolrood-vrije Hanks ‘ gebalanceerde zoutoplossing gemodificeerd met calcium en magnesium (HBSS). Aspirate HBSS en voeg 250 μL 5000 eenheden/mL Collagenase IV toe in 10 mL HBSS. Incuberen bij 37 °C gedurende 45 min. Aspirate HBSS met collagenase IV en was één keer met 5 mL PBS. PBS en voeg 5 mL 0,25% trypsine-EDTA toe. Inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. Voeg vervolgens 4 ml OP9 media toe en dissocieren de cellaag door Pipetteer om een eencellige suspensie te maken. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef van 100 μm.  Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant en respenderen in 10 mL van OP9 media. Plaat celsuspensie op een nieuwe gegelatiniseerde 10 cm celcultuur Petri schaal (Zie stappen 3.1.1 en 3.1.2). Inincuberen bij 37 °C gedurende 45 min. Verzamel vervolgens niet-aanhangende cellen door voorzichtig pipetteren. Breng verzamelde celsuspensie over in een conische buis van 50 mL door middel van een celzeef van 100 μm.  Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant en respenderen in 10 mL differentiatie media [OP9 media met 5 ng/mL humane stamcel factor (hSCF), 5 ng/mL humane Flt3 ligand (hFLT3L), en 5 ng/mL Human Interleukine 7 (hIL-7)]. Plaat de celsuspensie op een nieuwe 10 cm OP9/DLL1-Confluent Health schotel. Op dag 16, doorgang van de cellen. Verwijder mechanisch niet-aanhangende cellen door voorzichtig te pipetteren en filtreer door een 100 μm-celzeef. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Aspireren de supernatant en respenderen in 10 mL differentiatie media. Plaat de celsuspensie op een nieuwe 10 cm OP9/DLL1-Confluent Health schotel. Ga daarna elke 5-7 dagen door met het doorvoeren van niet-aanhangende cellen door stap 3,8 te herhalen. Op dag 35, verrijken CD4+CD8+ dubbele positieve (DP) populatie en stimuleren om te produceren CD8αβ+ SP T cellen (figuur 2). Koppel niet-aanhangende cellen mechanisch af door voorzichtig te pipetteren en filtreer door een 100 μm-celzeef om celklonten te verwijderen. Verrijken CD4+ celpopulatie door CD4 magnetische kraal isolatie volgens het Protocol van de fabrikant.Opmerking: de reden voor het gebruik van CD4-magnetische kralen is het verwijderen van CD4-CD8-DN- cellen uit de cultuur, omdat deze zijn aangetoond dat het direct doden van CD4+CD8+ DP-cellen na stimulatie22. Tel levende CD4 verrijkte cellen met behulp van een Neubauer hemocytometer en Trypaanse blauwe kleurstof.  Opschorten in OP9 media bij totale concentratie 0,5 x 106 cellen/ml. Aliquot 1 mL van de celsuspensie (0,5 x 106 cellen) in elke put van een weefselcultuur vlakke bodem 24 goed plaat van CONFLUENT Health OP9/dll1-. Voeg 100 IU Human Interleukine 2 (hIL-2), 5 ng/mL hIL-7, 500 ng/mL anti-humaan CD3 antilichaam en 2 μg/mL anti-humaan CD28 antilichaam toe, dan cultuur bij 37 °C. Op dag 4-7 na stimulatie, verzamel cellen voor moleculaire analyse (Figuur 3) of co-cultuur met peptide-gepulseerd antigeen cellen (apc’s). 4. het meten van antigeen specificiteit van hiPSC afgeleide CD8αβ+ SP T cellen Opmerking: Het type APCs dat voor deze experiement moet worden gebruikt, is afhankelijk van de MHC-beperking van de met hiPSC afgeleide T-cellen. Hier wordt T2-cellijn gebruikt, wat een hybride is van T-en B-lymfoblastoïde cellijnen. T2-cellen Express HLA-A * 02:0123, die wordt herkend door JKF6 cellen waaruit MART1-IPSC is afgeleid18. Deze T2-cellijn kan worden uitgebreid in RPMI 1640 + 20% FBS + 1x penicilline-streptomycine en wordt doorgegeven wanneer cellen een dichtheid van 5 x 105 cellen/ml bereiken. Tel Live HLA-A * 02:01+ T-B hybride lymfoblastoïde T2 cellen met behulp van een Neubauer hemocytometer en trypan blauwe kleurstof. Incuberen Apc’s in 24 goed weefselkweek plaat met 1 μg/mL MART-1 peptide voor 2 uur bij 37 °C.Opmerking: Optimale peptide concentratie is variabel, afhankelijk van de cellijn en antigeen specificiteit. Verzamel Apc’s en was 2x met 10 mL PBS om extra peptide te verwijderen. Tellen Apc’s en opschorten op 2 – 5 x 105 cellen/ml in OP9 media met 100 IU Il-2 en 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL celsuspensie (2-5 x 104 cellen) in elke put van een ultra-low aanbouw U onder 96 goed plaat of rechtstreeks in een Voorgecoate ELISPOT plaat. Sorteer hiPSC-afgeleide CD8αβ+ SP T cellen (1 week na anti-humane CD3/CD28 antilichaam stimulatie) met behulp van een celsorteerder en op te schorten bij 1 x 106 cellen/ml in OP9 media met 100 IU Il-2 en 5 ng/ml Il-7. Aliquot 100 μL celsuspensie (1 x 105 cellen) in elke put van apc’s en cultuur voor 16-20 uur bij 37 °c. Analyseer na 16-20 uur het cytokine-secretie profiel door de ELISpot-test volgens het Protocol van de fabrikant (Figuur 4).

Representative Results

Na 13 dagen werd hiPSCs co-culturing met OP9/DLL1-, CD34+CD43+ hematopoietische voorlopercellen verschenen (Figuur 1). Na een extra 22 dagen van de cultuur op niet-gelatiniseerde OP9/DLL1-in de aanwezigheid van hSCF, hFLT3L, en hIL-7, hematopoietische voorlopercellen gedifferentieerd in CD3+CD7+CD4+CD8+ Double-positieve (DP) T Lineage Cells, de de meeste van die specifieke TCR uitgedrukt voor de Mart-1 epitoop (Tetramer) (Figuur 2). Het is eerder aangetoond dat CD8+ SP T cellen kunnen worden geïnduceerd uit CD4+CD8+ DP T cellen door TCR signalering via agonist peptide of antilichaamgestuurde TCR stimulatie24,25. Daarom werden op dag 35 van de cultuur, hiPSC-afgeleide CD4+CD8+ DP T-cellen gestimuleerd met anti-menselijke CD3 en anti-humane CD28 antilichamen in de aanwezigheid van hIL-7 en hIL-2.  Vier dagen na de stimulatie nam het aantal CD3+CD8αβ+ SP-cellen dramatisch toe en bleef specifiek voor de Mart-1-epitope, waarbij het behoud van hun erfelijke antigeen-specificiteit werd bevestigd (Figuur 3). Om de functionele eigenschappen van de hiPSC-afgeleide CD8αβ+ SP T-cellen te bepalen, werd antigeen-afhankelijke activering en secretie van interferon-gamma (IFN-γ) geanalyseerd. Na stimulatie met anti-humane CD3 en anti-humane CD28 antilichamen gedurende 1 week, werden hipsc-afgeleide CD8αβ+ SP T-cellen geïsoleerd met behulp van een celsorteerder en co-gekweekt met T2-cellijn met het uitdrukken van HLA-a * 02:01 met of zonder verwant MART1 peptide voor 16-20 h. De ELISpot assay onthulde dat hiPSC-afgeleide CD8αβ+ SP t-cellen hogere hoeveelheden IFN-γ afscheiden in vergelijking met CD8αα+ SP t-cellen, wanneer gekweekt in de aanwezigheid van Mart-1-peptide. IFN-γ-expressie was Null voor T-cellen en Apc’s alleen, en toonde aan dat menselijke T-iPSC-afgeleide T-cellen antigeen-specifiek en functioneel zijn (Figuur 4). Figuur 1: aanmaak van hematopoietische voorlopercellen van hipsc. (A) schematisch overzicht van de differentiatie van hipscs tot hematopoietische afstamming met behulp van OP9/dll1–co-cultuur. B) het uiterlijk van de hipsc-afgeleide structuren op dag 1 (linksboven), 3 (rechtsboven), 7 (linksonder) en 13 (rechtsonder). Schaal staven = 100 μm. (C) flowcytometrische analyse van hipsc afgeleide CD34+CD43+ hematopoietische voorlopercellen op dag 13. Gegevens zijn representatief voor zes onafhankelijke experimenten (n = 1 tot 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: hiPSC-differentiatie in Mart1+ CD4+CD8αβ+ DP T-cellen. (A) schematisch overzicht van de differentiatie van hematopoietische afstamming van hipsc tot onvolgroeide T-cellen die OP9/dll1–co-cultuur gebruiken. B) flowcytometrische analyse van CD4 vs. CD8Α, CD3 vs. CD8β, en Mart-1 tetrameer expressie in de hipsc-afgeleide T-cellen op dag 35. Gated op lymfocyten, enkelvoudige cellen, PI negatief. Gegevens zijn representatief voor drie onafhankelijke experimenten (n = 3-8). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: inductie van CD8αβ+ SP T-cel fenotype. Flowcytometrische analyse van de CD4- hipsc-afgeleide T-cellen 4 dagen na humane anti-CD3 en humane anti-CD28 antilichaam-gedreven stimulatie. Op lymfocyten, enkelvoudige cellen, PI-negatief (n = 4).   Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: antigeen specificiteit van de hipsc-afgeleide CD8αβ+ SP T-cellen. IFN-γ secretie door ELISpot assay van hiPSC-afgeleide CD8αβ+ SP, CD8αα+ SP, en bulk T cellen na 20 h co-cultuur met of zonder T2 cellen gepulseerd (of niet) met Mart-1 peptide. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

De co-cultuur van OP9 Murine stromale Cells is een goed opgezet systeem voor in vitro generatie van lymfocyten (d.w.z. NK-, B-en T-cellen) van Hspc’s en pluripotente stamcellen. Inkeping signalering is vereist voor het induceren van T Lineage verbintenis en kan worden bereikt door de ectopische uitdrukking van Inkeping ligand DLL1-of DLL4, die vergelijkbare werkzaamheid voor T-cel generatie1hebben. Daarom is het OP9/DLL1-co-Culture-systeem een veelgebruikte methode geworden voor het produceren van T-cellen in vitro.  Bovendien is deze methode toepasbaar voor gebruik met verschillende soorten en bronnen van menselijke cellen, waaronder snoer bloed, beenmerg Hspc’s en Esc’s.  De generatie van T-cellen uit deze bronnen wordt echter beperkt door onvoldoende broncellen op te halen of door inefficiënte differentiatie naar T-cellen1. Bovendien kan een T-celproduct met een enkele TCR-recombinatie niet worden gegenereerd uit deze open repertoire bronnen. Door gebruik te maken van regeneratieve geneeskunde technieken, namelijk geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie (iPSC), kan het mogelijk zijn om massale aantallen antigeen-specifieke T-cellen te produceren voor gebruik in cel-based Therapeutics15.

hiPSCs zijn vergelijkbaar met pluripotente Esc’s in hun capaciteit voor zelf vernieuwing, onbeperkte expansie en potentieel om te differentiëren naar elk type somatische cel in het lichaam; ze missen echter de ethische bezwaren rond het gebruik van producten van embryonale oorsprong voor klinische toepassingen. Bovendien kunnen hiPSCs worden geproduceerd uit elke somatische cel, waardoor de ontwikkeling van celproducten voor gepersonaliseerde geneeskunde mogelijk is. In eerdere rapporten werden hipscs geproduceerd uit menselijke t-cellen met hele perifere mononucleaire cellen, CD3+ cellen of geïsoleerde cytotoxische T-lymfocyten (ctl’s) als bron18,19,22, 26. Wanneer de hiPSCs worden opgewekt uit een t-celbron (t-iPSCs), wordt de oorspronkelijke TCR-genherschikking overgenomen. Daarom, patiënt T-iPSC afgeleide T cellen kunnen bieden een model voor gepersonaliseerde ACT behandeling door het richten van een patiënt verschillende kanker antigenen.

De differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in T-Lineage cellen is onderverdeeld in twee stappen: de generatie van hematopoietische voorlopercellen (Hpc’s)27 en hun verdere differentiatie in t-Lineage cellen21. Beide stappen kunnen worden uitgevoerd met behulp van het OP9/DLL1-co-Culture systeem. Belangrijk is dat de kwaliteit van de OP9/DLL1-feeder cellen cruciaal is voor het succes van T-celdifferentiatie. Aangezien OP9/DLL1-cellen niet een vereeuwigd homogene cellijn zijn, zijn de kwaliteit van de FBS en cultuuromstandigheden van cruciaal belang voor het behoud van hun expansie zonder verlies van de mogelijkheid om de hiPSC-differentiatie te ondersteunen. Daarom is het raadzaam om vooraf te evalueren van de lot van FBS en passage consequent wanneer cel-naar-cel cytoplasma contact begint te treden, om te voorkomen dat celdifferentiatie en senescentie. Een punt om in aanmerking te nemen is dat cel-naar-cel contact kan lijken te onderscheiden van de achtergrond afhankelijk van het fase contrast en vergroting van de Microscoop. In onze ervaring, de meeste OP9/DLL1-gerechten zal blijken te zijn 80% Confluent Health wanneer klaar om te passeren.

Het is aangetoond dat de geherdifferentieerde t-Lineage cellen gegenereerd uit t-ipscs door OP9/dll1-co-cultuur CD8+ SP T cellen kunnen produceren op stimulatie18,19. Echter, geregenereerde CD8+ SP T cellen verwerven de aangeboren-achtige CD8αα homodimer22,28, dat is een ineffectieve co-receptor voor TCR signalering29.  Bovendien hebben deze geregenereerde CD8+ SP T-cellen sterke TCR-onafhankelijke cytotoxiciteit laten zien, waardoor deze cellen ongunstig zijn voor klinisch gebruik30. Dit protocol beschrijft een recente methode met betrekking tot stimulatie van gezuiverde CD4+CD8+ DP-cellen voor het genereren van CD8αβ+ SP T cellen met een meer conventionele fenotype en verbeterde antigeen-specifieke cytotoxiciteit22. Hoewel het verlies van antigeen specificiteit als gevolg van secundaire tcrα-allel-herschikking optreedt in de DP-fase na langdurige lange-termijn cultuur, kan dit worden overwonnen door genoom bewerking in T-ipscs31.  In onze ervaring, hiPSC-afgeleide DP cellen beginnen te verschijnen op dag 30-35 van cultuur, en deze nieuw gegenereerde DP cellen hebben nog niet ondergaan secundaire TCRα herschikking. Daarom, de meeste DP cellen op dag 35 behouden antigeen specificiteit en kan worden gebruikt voor het genereren van antigeen-specifieke CD8αβ+ SP T cellen.

Voorafgaand aan humane anti-CD3 en anti-CD28 stimulatie op dag 35, moeten CD4-CD8-DN- cellen uit de cultuur worden verwijderd, omdat deze zijn aangetoond dat het direct doden van CD4+CD8+ DP–cellen na stimulatie22veroorzaakt. Met behulp van CD4 magnetische kraal verrijking (stap 3,10) zal verrijken voor zowel DP en CD4+CD8– INTERMEDIATE enkelvoudige positieve (ISP) cellen1, waarvan we hebben aangetoond dat er geen negatieve effecten22. Als alternatief kan fluorescentie-geactiveerde celsortering door flow cytometrie worden uitgevoerd om DP-cellen te isoleren. Echter, magnetische kraal scheiding heeft de voorkeur als het vermijdt de mechanische stress veroorzaakt doorstroming cytometrie.

De generatie van CD8αβ+ SP T cellen uit menselijke pluripotente stamcellen zonder activatie-gemedieerde agonist selectie is vervolgens aangetoond door het gebruik van 3D Murine stromale Cell Culture32. Fysiologische positieve selectie is echter afhankelijk van de interactie van TCR met self-peptide-MHC-complexen, die uniek worden verwerkt en gepresenteerd door Thymus corticale epitheelcellen33. Bovendien is aangetoond dat de TCR-affiniteit voor selectie peptiden de daaropvolgende functionele mogelijkheden van mature CD8αβ+ SP T-cellen34bepalen.  Op dit moment is er geen bewijs om te suggereren dat een notch stromale Cell-gebaseerd co-cultuur systeem de gedefinieerde selectie peptide en MHC-complex vereist voor fysiologische positieve selectie kan bieden.

Het is eerder gemeld in een Murine model dat T Lineage cellen gegenereerd uit tumor antigen-specifieke T-cel-afgeleide hiPSCs met behulp van OP9/DLL1-alleen niet om conventionele rijping te ervaren. Echter, IPSC-afgeleide onrijpe t cellen gegenereerd door de OP9/dll1-systeem kan rijpen in naïeve-achtige t cellen door verdere fysiologische Thymus onderwijs in een 3D-cultuur systeem 28,35. Daarom is het protocol dat hier wordt gepresenteerd om door het OP9/DLL1–systeem gegenereerde onrijpe T-cellen van iPSC te produceren, van vitaal belang voor verdere pogingen om echte menselijke tumor-antigeen-specifieke post-thymale T-cellen te genereren die in vivo op lange termijn persistentie kunnen efficiëntie voor de behandeling van gevestigde gevasculariseerde tumoren.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Alan B. Hoofring en Erina H. Hij voor grafische hulp. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Cancer Institute (ZIA BC010763) en het intramurale NCI Cancer moonshot Initiative voor cel-gebaseerde kanker immunotherapie.

Materials

10 cm dish Corning, Inc.  353003
Anti-CD3, human BD Biosciences Cat# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, human BD Biosciences Cat# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, human Biolegend Cat# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, human BD Biosciences Cat# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, human BD Biosciences Cat# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, human BD Biosciences Cat# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, human BD Biosciences Cat# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, human BD Biosciences Cat# 555548, RRID:AB_395932
CD28 human monoclonal antibody (15E8), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-375
CD3 human monoclonal antibody (OKT3), pure functional grade Miltenyl Biotec 130-093-387
CD4 Microbeads, human Miltenyl Biotec 130-045-101
Cell strainer 100 um Fisher Scientific 22-363-549
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini 100-500
Flt-3 ligand R&D Systems 427-FL
Gelatin Solution 2%  SIGMA-Aldritch G1393-100ML
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine supplement
HBSS Mg+Ca+ Phenol-Red Free Gibco 14025-092
Interleukin-2 R&D Systems 202-IL
Interleukin-7 R&D Systems 407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV MBL Cat#TB-0009-2
Mart1-hiPSC Vizcardo et al., Cell Stem Cell 2013 RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35) InnoPep 3146-0100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
αMEM powder Gibco 61100061
Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) Thermo Fisher Scientific C57BL/6 MEF MITC-TREATED 4M EACH; A34962
OP9/N-DLL1 Riken Bioresource center Cat# RCB2927; RRID:CVCL_B220 OP9/DLL1
Penicillin/streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Primate ES Cell Medium Reprocell RCHEMD001 Human ESC Culture Media
Rhok inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) Tocris 1254
RPMI 1640 Gibco 11875093
Stem Cell Factor (SCF) R&D Systems 455-MC
StemPro EZPassage 23181-010
T2-tumor ATCC T2 (174 x CEM.T2) (ATCC® CRL-1992™) 
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-062
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25200-072
U Bottom 96 well plate Corning, Inc.  3799
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brauer, P. M., Singh, J., Xhiku, S., Zuniga-Pflucker, J. C. T Cell Genesis: In Vitro Veritas Est. Trends in Immunology. 37 (12), 889-901 (2016).
  2. Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. Science. 348 (6230), 62-68 (2015).
  3. Gattinoni, L., et al. Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells. Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).
  4. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T-cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  5. Crompton, J. G., et al. Lineage relationship of CD8(+) T cell subsets is revealed by progressive changes in the epigenetic landscape. Cellular and Molecular Immunology. 13 (4), 502-513 (2016).
  6. Henning, A. N., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. Silencing stemness in T cell differentiation. Science. 359 (6372), 163-164 (2018).
  7. Henning, A. N., Roychoudhuri, R., Restifo, N. P. Epigenetic control of CD8(+) T cell differentiation. Nature Reviews Immunology. 18 (5), 340-356 (2018).
  8. Vodnala, S. K., et al. T cell stemness and dysfunction in tumors are triggered by a common mechanism. Science. 363 (6434), (2019).
  9. Restifo, N. P., Gattinoni, L. Lineage relationship of effector and memory T cells. Current Opinion in Immunology. 25 (5), 556-563 (2013).
  10. Tran, E., et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science. 344 (6184), 641-645 (2014).
  11. Gattinoni, L., et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).
  12. Gautam, S., et al. The transcription factor c-Myb regulates CD8(+) T cell stemness and antitumor immunity. Nature Immunology. 20 (3), 337-349 (2019).
  13. Klebanoff, C. A., et al. Determinants of successful CD8+ T-cell adoptive immunotherapy for large established tumors in mice. Clinical Cancer Research. 17 (16), 5343-5352 (2011).
  14. Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting through subsets: which T-cell populations mediate highly effective adoptive immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
  15. Crompton, J. G., Clever, D., Vizcardo, R., Rao, M., Restifo, N. P. Reprogramming antitumor immunity. Trends in Immunology. 35 (4), 178-185 (2014).
  16. Crompton, J. G., Rao, M., Restifo, N. P. Memoirs of a reincarnated T cell. Cell Stem Cell. 12 (1), 6-8 (2013).
  17. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2 (6), 1722-1735 (2012).
  18. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  19. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  20. Lo, W., et al. Immunologic recognition of a shared p53 mutated neoantigen in a patient with metastatic colorectal cancer. Cancer Immunology Research. , (2019).
  21. Timmermans, F., et al. Generation of T cells from human embryonic stem cell-derived hematopoietic zones. Journal of Immunology. 182 (11), 6879-6888 (2009).
  22. Maeda, T., et al. Regeneration of CD8alphabeta T Cells from T-cell-Derived iPSC Imparts Potent Tumor Antigen-Specific Cytotoxicity. Cancer Research. 76 (23), 6839-6850 (2016).
  23. Salter, R. D., Howell, D. N., Cresswell, P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B lymphoblast hybrids. Immunogenetics. 21 (3), 235-246 (1985).
  24. Snauwaert, S., et al. In vitro generation of mature, naive antigen-specific CD8(+) T cells with a single T-cell receptor by agonist selection. Leukemia. 28 (4), 830-841 (2014).
  25. Takahama, Y., Suzuki, H., Katz, K. S., Grusby, M. J., Singer, A. Positive selection of CD4+ T cells by TCR ligation without aggregation even in the absence of MHC. Nature. 371 (6492), 67-70 (1994).
  26. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  27. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
  28. Vizcardo, R., et al. Generation of Tumor Antigen-Specific iPSC-Derived Thymic Emigrants Using a 3D Thymic Culture System. Cell Reports. 22 (12), 3175-3190 (2018).
  29. McNicol, A. M., et al. CD8alpha/alpha homodimers fail to function as co-receptor for a CD8-dependent TCR. European Journal of Immunology. 37 (6), 1634-1641 (2007).
  30. Themeli, M., Riviere, I., Sadelain, M. New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy. Cell Stem Cell. 16 (4), 357-366 (2015).
  31. Minagawa, A., et al. Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy. Cell Stem Cell. 23 (6), 850-858 (2018).
  32. Montel-Hagen, A., et al. Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 24 (3), 376-389 (2019).
  33. Takada, K., Kondo, K., Takahama, Y. Generation of Peptides That Promote Positive Selection in the Thymus. Journal of Immunology. 198 (6), 2215-2222 (2017).
  34. Takada, K., et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells. Nature Immunology. 16 (10), 1069-1076 (2015).
  35. Vizcardo, R., et al. A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants. JoVE. , e58672 (2019).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem CellsTumor Antigen-specific T CellsOP9-Delta-1 Co-cultureT Cell GenerationRegenerative MedicineCell-based TherapyNK CellsCell DifferentiationCell PassagingMouse Embryonic FibroblastsOP9 Media

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Good, M. L., Vizcardo, R., Maeda, T., Tamaoki, N., Malekzadeh, P., Kawamoto, H., Restifo, N. P. Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells. J. Vis. Exp. (152), e59997, doi:10.3791/59997 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image