使用CRISPR-Cas9在蜜蜂脑科进行抗RDL和抗mGGR1受体抗体测试

此处描述的协议遵循亚利桑那州立大学的动物护理指南。 1. 从阿皮斯梅利韦拉大脑完全蛋白质分离 注：使用阿皮斯·梅利韦拉新世界卡尼奥兰觅食者未知年龄的这个实验。 在蜂巢入口放置一个铝网屏，以捕捉前兆蜜蜂17。将每一蜜蜂捕获到小瓶中，每个瓶盖上有一个小孔。将装有蜜蜂的小瓶放入冰中，以降低其体温并固定它们。将蜜蜂留在冰上不超过3分钟。 将固定的蜜蜂固定到先前准备好的金属支架中。确保金属支架的构造，以便蜜蜂可以使用小块胶带固定，但仍有其后胸、翅膀和头部暴露。注意：在尝试将蜜蜂置于支架中之前，请确保蜜蜂完全固定。 使用 5 mL 注射器用 1 M 蔗糖溶液喂蜜蜂，直到它们不再饥饿。将固定的蜜蜂放在装有湿纸巾的盒子里，以确保环境潮湿。 用巴拉克尔虹膜剪刀（见材料表）快速切除蜜蜂的大脑，用剪刀从前面打开头部。 切断大脑从头部胶囊，采取#5钳子的大脑，并将其放置在100μL的冷（4-8°C）的开瓶缓冲液。莱沙缓冲液由 120 mM Tris-HCl 组成， 2% 硫酸二钠 （SDS）， 5% 甘油， 0.2 mM 二硫磷醇， 1% Triton X-100， 和 1-5 μg/mL 的蛋白酶抑制剂 PMSF （苯基甲基硫磷脂）， 丙氨酸， 苯甲酰胺 （pH 6.8） 在 4 °C.通过在一个虫子中转动大约2分钟，使大脑在解液溶液中均匀化。 在12，000 x g下离心样品20分钟。将上清液的吸气90μL吸气，并丢弃颗粒。 取1μL的上清液，使用荧光计定量总蛋白质。总蛋白质的大约浓度为每只蜜蜂2-3毫克/毫克。取上清液10μL，加入10μL的莱沙缓冲液和10μL的6x莱姆利缓冲液18。短暂旋转并煮3分钟，然后在冰上冷却。在 10，000 x g下旋转 1 分钟，以清除所有碎屑。十分之一的蜜蜂大脑含有大约25纳克的总蛋白质。 2. 西印19 使含有 12.15 mL 的超纯蒸馏水的 10% 跑步凝胶达到 30 mL， 7.5 m M Tris-HCl （pH 8.8），0.3 mL 10% SDS，10 mL 30% 丙烯酰胺溶液，0.15 mL 10% 过硫酸铵 （APS），以及 20 μL 的四甲基二胺 （TEMED). 在两个由垫片隔开的玻璃板之间铸造凝胶。 制作含有12.1 mL超纯蒸馏水、5.0 m L 0.5 M Tris-HCl（pH 6.8）、0.2 mL 10% SDS、2.6 mL丙烯酸乙酰丙烯酰胺、0.1 mL 10% APS和 20 μL的 TEMED 的 20 mL 堆叠凝胶。 当运行的凝胶凝固时，倒入堆叠凝胶。小心地添加塑料分离器以铸造装载通道，避免气泡。等待 15-30 分钟，直到凝胶凝固。 使用 5 μL 的蛋白质标准开始加载凝胶。每车道步骤1.8加载20μL的酸莉酸混合物，对应于蜜蜂大脑的±1/15或每条通道总蛋白质的±16 ng。在堆叠凝胶中运行样本总值为 3.5-4 h，在堆叠凝胶中运行 32 mA。当染料离开凝胶时停止。 将蛋白质转移到转移缓冲液中的硝化纤维素膜（25 mM Tris-HCl，192 mM 甘氨酸，15% 甲醇），在 0.45 mA 下在 4°C 下传输 1 小时 30 分钟。 为了在免疫镀金前评估SDS-PAGE后蛋白质转移的效率，添加Ponceau S染色溶液（向水中加入0.1克Ponceau S和5 mL醋酸，最终体积为100 mL）。储存在4°C下1分钟，用蒸馏水快速冲洗。 用圆珠笔标记每个车道，切割包含两条带脑均质的通道和一条带有蛋白质标记的通道的膜，并将每个通道放入一个西体斑点孵育盒中。在含有0.1%补间20（PBS-Tw）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，每洗3次5分钟。 用10%NGS（1mL的普通山羊血清至10mL的PBS-Tw）在西斑孵育盒中块膜1小时。使抗mGlutR1稀释（5μL抗体在10 mL中，10%NGS）。使抗RDL1和抗RDL2稀释（5μL抗体在10mL10%NGS每个）。用稀释的抗体替换每个包装盒中的阻滞溶液，并在4°C下过夜（16-24小时）。 在PBS-Tw中，将膜每洗3次5分钟，在室温（RT）下，用1：10，000在10%NGS PBS-Tw中孵育膜，用抗兔子IgG HRP-结合二级抗体孵育膜2小时。在 PBS-Tw 中清洗膜 3 倍，在 PBS 中洗 1 倍。 使用西方化学发光HRP基板检测带。在RT处混合两个基板1：1（v/v），将所有膜放在同一个盒子里，并用基板混合物覆盖2分钟（在暗室中，有红灯）。通常一个抗体在一个膜上测试，在两个或三个通道和一条带有重量标记的通道上含有相同的大脑均质稀释。 3. 免疫细胞化学程序 解剖蜜蜂的大脑进行免疫细胞化学，将蜜蜂固定在冰中30s。蜜蜂被固定后，用剪刀将蜜蜂斩首，并将头部放入PBS中4%的甲醛溶液中。在烟罩下工作。注意：身体必须小心处理，因为被斩首后腹部仍可能刺痛。 小心但迅速删除天线，复合眼睛，并削减所有的顶部外骨骼与Barraquer虹膜剪刀。让头部在固定溶液中坐10分钟。取出头部外骨骼的其余部分，并切下所有剩余的气管。 将每个大脑放入含有至少1 mL 4%甲醛溶液的1.5 mL微离心管中，并在4-8°C下过夜。 将 3.8 克的甘蔗和 50 mL 的蒸馏水混合在 Erlenmeyer 烧瓶中，制作 7.6% 的甘草溶液。微波溶液，直到甘蔗液化。注：可在烧瓶开口放置一小片纸巾，以防止在加热过程中使格贺花溶液溢出。 将固定的蜜蜂大脑（3-4个大脑）放入35毫米培养皿中，用纸巾去除多余的固定剂。将液体甘蔗溶液倒在大脑上。将大脑定向到绞叶中，使天线叶朝上。让糖冷却和凝固。 在阿加罗斯凝固后，切出含有大脑的甘蔗块。 对于振动孔切片，准备一个24孔板，每口井都装有一个篮子，底部有一个疏水网。用 600 μL 的 PBS 填充每个井。 使用振动器将每个截块切成 70 μm 横截面，并将截面放入包含 PBS 的篮中。注：确保同一大脑的部分放在同一个篮子中。 用PBS-TX清洗大脑部分6次，每次10分钟，以确保各部分没有固定性残留。将多孔板放在轨道摇床上，以 210 rpm 转速洗净大脑。每次清洗前，请务必使用新鲜的 PBS-TX 解决方案替换 PBS-TX 解决方案。在最后一次洗涤时用1%正常驴血清块。 要测试抗mGGR1原抗体，通过在15 mL离心管中加入9 mL的PBS-TX抗mGR1抗体，制备1：112稀释抗mGGR1抗体。旋管短暂混合彻底。初步实验确定了抗体的工作稀释。 要测试抗RDL原抗体，在15 mL离心管中加入30μL的抗RDL肽1、30μL抗RDL肽2和6 mL的PBS-TX，制备1：100稀释抗RDL抗体。旋管短暂混合彻底。初步实验确定了抗体的工作稀释。 在板中的每口孔中加入800μL的抗体溶液。盖上多孔板并将其包裹在铝箔中，以防止光线照射导致降解。将包裹在铝箔上的板放在轨道摇床上，在 210 rpm 转速下摇动 2 小时。然后在RT过夜，不摇晃。 大脑部分过夜后，用PBS-TX清洗10分钟。重复洗涤步骤6倍。 通过在PBS-TX的9 mL中加入40μL的二级抗体，对二级抗体进行1：225稀释，制备二级抗体（来自驴的抗兔子）。 在每个井中加入800 μL的二次抗体稀释剂。盖上盘子，用铝箔包住。将包裹在铝箔上的板放在轨道摇床上，在 210 rpm 转速下摇动 2 小时。然后在RT过夜。 用PBS-TX清洗大脑部分3次，每次10分钟，用常规PBS溶液清洗3次。 要嵌入幻灯片中的部分，请准备从罗德里格斯等人20 中修改的安装介质/甘油嵌入溶液。在 20 mL PBS 中加入 5 g 的安装介质，用磁性搅拌器搅拌 16 小时。加入10 mL的甘油，用磁性搅拌器搅拌16小时。在4000 x g下离心15分钟，取液体均质上清液，在1mL管中等分。保持在-20°C 将部分嵌入到幻灯片上，并滴下步骤 3.17 中准备的安装介质，确保每张幻灯片包含来自一个大脑的部分。 结合肽免疫染色的增减控制 对于抗RDL和结合肽，通过谷醛在RT上孵化与相应的肽结合的抗RDL抗体的工作稀释：条件1）500μg肽与键孔林普血亚宁（KLH）通过谷醛结合;条件 2） 没有任何偶联。 在10，000 x g下将每种混合物离心10分钟，并从这两个条件下收集上清液（步骤3.19.1）。 用每个上清液孵育蜜蜂大脑的序列部分，并处理上述二级抗体。串行部分是在振动分块过程中相互遵循的部分，因此大脑的同一部分将暴露在正负对照下。 对于抗mGlutR1和偶联肽，在RT与含有10-4M肽（条件1）的KLH结合肽（条件1）和没有任何偶联（条件2））的抗mGGR1抗体的工作稀释。 在 10，000 x g下将每种混合物离心 10 分钟，并从两个对照组收集上清液。 用二级抗体（步骤3.14-3.15）从条件和过程中用上清液孵育蜜蜂大脑的序列部分。 使用嵌入介质将两个条件的节嵌入到幻灯片上（步骤 3.17）。 4. 在相应的CRISPR-Cas9系统注射后，在蜜蜂大脑中通过免疫细胞化学（第3节）对RDL和mGlutR1蛋白表达的测试 使用在线CRISPR-Cas9设计工具21使用AmRdl（XM_006565102.3）的基因组DNA序列和mGlutR1（XM_006566244.3）序列设计指南（表1）。在 5′ 末端使用荧光染料 ATTO550 订购为 Cas9 crRNA 和 Cas-9 tracRNA。订购 Cas9 核酸酶 V3（参见材料表）。 使用无核酸酶水制作每个导引crRNA和tracRRNA的100 μM库存，为CRISPR-Cas 9系统制备组件。在-20°C下，以-20°C的分量和储存。通过在47.5 μl无核苷酸缓冲液中加入2.5 μL Cas-9溶液，制备Cas-9溶液的工作浓度，以获得0.5μg/μL的最终浓度。使gRNA和RNP用于注射。 分别为每个导引RNA制备gRNA复合型（指南RNA：tracRNATO550） 用gRNA名称标记试管，加入92μL的无核苷酸缓冲液，4μL的100μM CRISPR-Cas9 tracrRNA-5’ATTO550，4μL的导引crRNA溶液。轻轻混合并旋转。注：RDL的gRNA管标记示例：GRDL1、GRDL2、GRDL3（与表1中的RDL指南RNA相对应）。mGlutR1 的 gRNA 管标签示例：GMGL1、GMGL2、GMGL3（表1）。 将溶液加热至95°C5分钟，形成gRNA。在 RT 处冷却混合物 10 分钟。 准备RNP复杂形成（gRNA：S.p Cas9核酸酶），输送混合物和控制。 用RNP名称标记试管，加入6μL的gRNA溶液和6μL的0.5μg/μL S.p Cas9核酸酶V3。在注射前，在37°C下轻轻混合并孵育溶液10分钟。注：RNP管标签示例：RRDL1、RRDL2、RRDL3。 制作 RNPRDLmix。要制备用于注射的最终混合物，请从 RDL 中加入每个 RNP 的 4 μL。RNP/RDL 组合 = 4 μL RRDL1 = 4 μL RRDL = 4 μL RRDL3。 制作 RNPmGlutR1 混合。将 mGlutR1 中每个 RNP 的 4 μL 混合在一起，制备用于注射的最终混合物 （RNPmGlutR1mix） = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3。注：RNP管标签示例：RMG1、RMG2、RMG3。 通过混合4μL的沙子RNA、92μL的缓冲液和4μL的水代替导引RNA（参见第4.3节），使控制无导RNA溶液。混合6μL的这种无导RNA溶液和6μL的0.5微克/μL Cas9核酸酶V3（步骤4.4.1）以产生对照注射溶液。 5. 注射程序 如步骤 1.3 所述，固定每个蜜蜂，并像步骤 1.4 中那样喂它们。接下来，准备两套两个木箱，在注射后将蜜蜂释放到其中：一个白色盒子（实验条件）和一个黑匣子（控制）。每个盒子应包含一个小梳子和一个喂食培养皿。每个盒子的一侧由玻璃制成，以便进行观察。 制作喂培养皿。取35毫米培养皿的盖子，将蜡放在表面内，并将培养皿的底部放在蜡上。将板固定到包装箱中。 使用 5 mL 注射器，在盖和盘底之间注射 1M 蔗糖溶液。蜜蜂可以迅速在两个板块之间放上前体，并持续干燥48小时。在每个盒子里放一道菜。 要准备显微注射系统，请用矿物油填充毛细血管，没有任何气泡。将毛细管放在显微喷射系统的喷油器支架中。要将毛细管装上所需的注射溶液，在平坦的表面上放置疏水膜，并将溶液移液到其上。从毛细血管中注入油，用相应的 RNP 混合物替换混合物。 使用显微注射系统，将345 nL的RNP混合物溶液直接注射到每一蜂的中间奥切利中。 对于 RDL-CRISPR-Cas9 注射，使用步骤 4.4.2 中所述制备的 RNPRDLmix 注射 8 只蜜蜂。注射后喂他们1M蔗糖。用小梳子在白色（实验）盒中释放它们，喂食培养皿48小时。使用另外八只蜜蜂作为对照，无需任何注射，喂食它们，并在黑色（对照）盒中释放它们。 对于 mGlutR1 CRISPR-Cas9，使用步骤 4.4.3 中所述制备的 RNPmGGR1mix 注射 9 只蜜蜂。对于对照注射8只蜜蜂的RNA混合物，无需按照步骤4.4.4所述制备导引（RNAmix_noguide）。注射后喂他们1M蔗糖。将蜜蜂从支架中释放到白盒（实验条件）或第 5.1 节中所述准备的黑匣子（控制）。 将箱子放入聚苯乙烯容器内，内装有湿纸，以便进行湿度处理。让蜜蜂离开48小时，每天观察2次，以确保它们有足够的食物和良好的湿度。 在48小时（步骤3.1）后解剖每只蜜蜂的大脑，并进行免疫细胞化学，如第3节所述。对于抗 mGlutR1 免疫染色使用步骤 3.11 和抗 RDL 免疫染色使用步骤 3.12。 执行共聚焦成像以评估免疫染色大脑部分的荧光水平。 为了评估免疫标记大脑中蛋白质的减少，在相同增益水平上使用共聚焦图像集合来控制和注射大脑。 6. 基于qPCR的落体测定，用于在CRISPR Cas9 RNPRDLmix注射后评估经过修饰的基因组RDL DNA 48 H 设计引材、控制探针和落水探头，以评估CRISPR-Cas9注射修饰的DNA量。每个引物的设计，使其侧翼至少一个CRISPR-Cas 9导板和放大剂大小为132 bp。使用的引注和探针如下：RDL1_For：CTCGGGACCATATRDL1_Rev：中国民航总局RDL1_control_probe： /5HEX/CGA_C_G_TTT_A_C_CT/3IABkFQ/RDL1_Drop-off_probe： /56-FAM/CCTA_C_G_T_CA_A+GT/3IABkFQ/ 确保引种对应于特定于区域的唯一序列。确保落客探头是为与 RDL-CRISPR-Cas9 导引体重叠的区域设计的。 要测试引导区域中的 gDNA 是否进行了修改，请使用步骤 5.3.1 中描述的RNP_RDL混合在 ocelli 中注入 12 个蜜蜂，并使用 8 个未注入的蜜蜂作为对照。 注射后，在没有视叶48小时后取出没有视叶的蜜蜂大脑，并按照制造商的协议（见材料表）使用试剂盒提取每个注射的蜂脑的gDNA（不含视叶）。 使用分光光度计评估提取的gDNA的数量、质量和纯度。 使用基于qPCR的落客协议和实时PCR循环器量化AmRDL改性gDNA的相对表达。 将寡聚物重新悬浮到100μM，将底漆稀释至10μM，将探针稀释至5μM。 设置96孔板中的PCR反应，如此处所示为gDNA的一个样本（3个重复）：10 μL的主混合物（见材料表），1 μL的正向底漆，1μL的反向引物，1μL的控制探针，1μL的下降探针，2μL的gDNA（50 ng），4μL的无核酸酶水，使最终反应体积达到20μL。注： 控件是解决方案，而不是样品和水，而不是探头。 设置循环程序如下，用于实时 PCR 循环器：95 °C 3 分钟，然后是 40 个循环 95 °C 15 秒，60°C 1 分钟。 使用 2-+Ct方法评估相对基因修饰，其中和 7. RNPRDLmix注射后RDL RNA 48 H的相对定量 要测试 RDL mRNA 是否减少，在 ocelli 中注入 20 个蜜蜂，RNP_RDL混合，如步骤 5.3.1 所述，并使用 12 个未注入的蜜蜂作为对照。注射后48小时，从每只注射的蜜蜂中提取总mRNA，并使用制造商的协议分离（见材料表）。 使用无DNA试剂盒清除样品中残留的任何DNA残留物（见材料表）。 使用分光光度计评估提取的RNA的质量和纯度。 使用市售的荧光绿色RT-PCR试剂盒（材料表）在实时PCR循环器上使用制造商对384孔板的协议量化AmRDL的表达。注：在本实验中，使用了以前发布的引信。对于AmRDL （AmRDL_F GGTCGATGGGCTATATATATATATTG;AmRDL_RTCGATATATATTCGCGTAGGA22和作为参考基因的引物[AmActin_FTGCCAACACTCTTTTTTG;AmActin_R大会23日。使用2-+Ct方法（步骤6.6）计算了相对基因表达。 8. 基于qPCR的落体测定，用于在RNPmGlutR1mix注射后评估修饰的基因组DNA48 H 设计引材、控制和落水探头，以评估CRISPR-Cas9注射修饰的DNA量。设计引物，使其侧翼至少一个CRISPR-Cas 9导板，放大子尺寸为96 bp。mGlutR1_For： GGTGAAACGAACGAGGAGGAAmGlurR1_Rev：加加加加加加加加加加加AmGlurR1_control_probe： /5HEX/CGAGG_G_AAA_CGA_GT/3IABkFQ/AmGlurR1_Drop-off_probe： /56-FAM/CGA_C_A_C_CG_TC/3IABkFQ/注： 确保引信对应于特定于应修改的区域的唯一序列。跌落探头设计用于与 CRISPR-Cas9 导轨重叠的区域。 要测试引导区域中的 gDNA 是否进行了修改，请使用步骤 5.3.1 中所述的 RNP_ GlutR1 混合物在 ocelli 中注入 12 个蜜蜂，并使用 8 个未注入的蜜蜂作为对照。 注射后48小时，从每个注射的蜜蜂大脑（无视叶）取出gDNA，并使用制造商的协议控制蜂脑（无视叶）（见材料表）。 使用分光光度计评估提取的gDNA的数量、质量和纯度。 使用 qPCR 下降协议和实时 PCR 循环器，量化 gDNA AmGlutR1 的相对修改，如步骤 6.5 中所述。 使用 2-+Ct方法评估相对基因修饰，其中和 9. RNPmGlutR1混合注射后mGlutR1 RNA 48 h的定量 要测试 mGlutR1 RNA mRNA 是否减少，请使用步骤 5.3.2 中所述的RNP_RDL混合物在 ocelli 中注入 6 只蜜蜂，并使用 6 只未注射的蜜蜂作为对照。注射后48小时，从每只注射的蜜蜂中提取总mRNA，并使用制造商的RNA分离协议分离蜜蜂大脑（无视叶）48小时（见材料表）。 使用无DNA试剂盒清除样品中残留的任何DNA残留物（见材料表）。 使用分光光度计评估提取的RNA的质量和纯度。 使用 SYBR 绿色 RT-PCR 套件（参见材料表）在实时 PCR 循环器上使用为 384 井套件提供的协议量化mGlutR1的表达。使用以下引物为mglutR1（mGlut_FCCCCCACGTCTCTCTCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTA;mGlut_RTGCCGTGTGTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTttttttttttt和actin引物经物作为参考基因[AmActin_FTGCCAACACTGTCTTCTG; AmActin_RGAATGACCACACACACA]。使用 2-+Ct方法（步骤 8.6）计算相对基因表达。