Examen de la dinámica de la adhesión celular y la propagación de células epiteliales en la fibronectina durante el estrés oxidativo

Las adherencias de matriz celular (es decir, adherencias focales) son complejos proteicos multimoleculares grandes y dinámicos que median la adhesión y la propagación celular. Estos procesos son críticos para el desarrollo de tejidos, el mantenimiento y la función fisiológica. Las adherencias focales se componen de receptores ligados a la membrana, como integrinas, así como proteínas de andamios que vinculan la actina citoesquelética con la matriz extracelular (ECM)¹. Estos complejos son capaces de responder a las señales fisioquímicas presentes en el entorno extracelular a través de la activación de varias vías de transducción de señalización. Como tal, las adherencias focales sirven como centros de señalización para propagar señales mecánicas extracelulares en una serie de procesos celulares, incluyendo migración dirigida, regulación del ciclo celular, diferenciación y supervivencia^1,2. Un grupo de moléculas de señalización que regulan e interactúan con adherencias focales incluye miembros de la familia Rho de pequeñas GTPases. Rho GTPases son proteínas clave que regulan la migración celular y la dinámica de adhesión a través de su activación espaciotemporal específica³. No es sorprendente, la desregulación de la función de la proteína Rho se ha implicado en un número de patologías humanas como metástasis, angiogénesis, y otros. De particular interés, el estado celular de redox desempeña un papel predominante en la modulación de la migración y adhesión celular. Se ha demostrado que las alteraciones en la homeostasis redox, como los aumentos de las especies reactivas de oxígeno (ROS), regulan la actividad de la proteína Rho, así como la adhesión, en varios tipos de células y enfermedades humanas^{4,5,6 ,7,8}. Por ejemplo, las personas que sufren del trastorno neurológico ataxia-telangiectasia (A-T), que es causada por una mutación en la reparación del daño del ADN serina/threonina quinasa A-T-mutada (ATM), tienen un mayor riesgo de cáncer metastásico^{9, 10}. La pérdida de actividad de la quinasa ATM en estos pacientes y líneas celulares, ya sea a través de mutación genética o inhibición química, resulta en altos niveles de estrés oxidativo debido a la disfunción de la vía del fosfato de pentosa^{7,11, 12}. Además, estudios recientes del laboratorio han puesto de relieve un papel fisiopatológico de ROS en A-T alterando la dinámica citoesquelética (es decir, la adhesión y la propagación) como resultado directo de la activación de la familia Rho GTPases in vitro⁵. En últimainstancia, estas alteraciones en la dinámica citoesquelética causada por la activación de la familia Rho pueden conducir al mayor riesgo de cáncer metastásico observado en pacientes con A-T^5,13. Por lo tanto, comprender la interacción entre las interacciones entre la matriz celular durante el estrés oxidativo puede proporcionar información sobre la regulación de la adhesión y la propagación. Estos estudios también pueden sentar las bases para más investigaciones sobre un posible papel para la familia Rho GTPases en estos procesos de señalización.

Descrito aquí es un protocolo para estudiar la dinámica celular temprana del ensamblaje de adhesión y la propagación durante el estrés oxidativo causado por la inhibición de la actividad de la quinasa ATM. Este ensayo se basa en el mecanismo bien caracterizado de adhesión de las células dependientes del anclaje a la fibronectina proteica ECM (FN). Cuando las células mantenidas en suspensión se chapan en FN, varias Rho GTPases coordinan el control de la remodelación citoesquelética actina^3,14. Los cambios morfológicos se observan a medida que las células cambian de redonda y circular en apariencia a aplanadas y expandidas. Concomitante con estas observaciones es el desarrollo de numerosas adherencias de matriz con el ECM. Estos cambios se atribuyen a la activación bifásica de RhoA con Rac1 durante la primera hora a medida que las células se adhieren y se extienden ^15,16.

Se han utilizado una variedad de métodos para examinar la morfología y la dinámica de adhesión, así como la propagación celular. Sin embargo, estos métodos se basan en sofisticados sistemas de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) a largo plazo, imágenes en vivo o sistemas de microscopía confocal. Por lo tanto, los usuarios deben tener acceso a equipos y software especializados. Además, el tiempo de configuración requerido por estos sistemas de bioimágenes hace que la captura de eventos de adhesión temprana sea un reto, especialmente cuando se prueban múltiples inhibidores o condiciones de tratamiento simultáneamente.

Los métodos detallados, aquí, proporcionan una forma directa, económica y cuantitativa de evaluar los parámetros que rigen el ensamblaje de adhesión y la propagación in vitro. El protocolo se realiza utilizando equipos de laboratorio comúnmente disponibles, como un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD. Este ensayo implica la aplicación de células dependientes del anclaje a una superficie recubierta de FN después de un período de estrés oxidativo causado por la inhibición química de la actividad de la quinasa ATM, que se ha demostrado previamente⁵. Después del revestimiento, las celdas se pueden unir y adherir durante períodos de tiempo especificados. Las células no conectadas se lavan, mientras que las células adheridas se fijan y etiquetan con anticuerpos basados en fluorescencia a marcadores de adhesión (por ejemplo, paxillina) y que se propagan (por ejemplo, F-actina)^2,5. Estas proteínas se visualizan y registran mediante un microscopio de epifluorescencia. El análisis de datos posterior se realiza utilizando el software de Fiji disponible libremente. Además, este método se puede adaptar para examinar la dinámica de adhesión en una amplia gama de condiciones, incluyendo diferentes proteínas ECM, tratamiento con diversos oxidantes /condiciones de cultivo celular o una variedad de líneas celulares dependientes del anclaje para abordar una amplia gama de preguntas biológicas.