Изучение динамики клеточной адгезии и распространения эпителиальных клеток на фибронектин во время окислительного стресса

Клеточные матричные спайки (т.е. очаговые спайки) представляют собой крупные и динамические многомолекулярные белковые комплексы, которые посреднику клеточной сцепления и распространения. Эти процессы имеют решающее значение для развития тканей, поддержания и физиологической функции. Фокусные спайки состоят из мембранных рецепторов, таких как целы, а также строительных лесов белков, которые связывают цитоскелет актин с внеклеточной матрицы (ECM)¹. Эти комплексы способны реагировать на физиохимические сигналы, присутствующие во внеклеточной среде, путем активации различных сигнальных путей трансдукции. Таким образом, координационные спайки служат в качестве сигнальных центров для распространения внеклеточных механических сигналов в ряд клеточных процессов, включая направленную миграцию, регулирование клеточного цикла, дифференциацию и выживание^1,2. Одна группа сигнальных молекул, которые регулируют и взаимодействуют с координационными спайсами, включает в себя членов семейства Rho малых GTPases. Rho GTPases являются ключевыми белками, которые регулируют миграцию клеток и динамику адгезии через их специфическую пространственно-временной активации^3. Неудивительно, что дисрегуляция функции белка Rho была вовлечена в ряд человеческих патологий, таких как метастаз, ангиогенез, и другие. Особый интерес представляет клеточный статус редокса, который играет доминирующую роль в модуляции миграции клеток и сливок. Изменения в редокс гомеостаза, такие как увеличение реактивных видов кислорода (ROS), были продемонстрированы для регулирования активности белка Rho, а также сливки, в ряде типов клеток и заболеваний человека^{4,5,6 ,7,8}. Например, лица, страдающие от неврологического расстройства атаксия-телеангиэктазия (A-T), который вызван мутацией в восстановлении повреждения ДНК serine/threonine kinase A-T-mutated (ATM), имеют повышенный риск метастатического рака^{9, 10}. Потеря активности атм киназы у этих пациентов и клеточных линий, либо через генетическую мутацию или химическое ингибирование, приводит к высокому уровню окислительного стресса из-за дисфункции пентозы фосфата путь^{7,11, 12}. Кроме того, недавние исследования из лаборатории выявили патофизиологическую роль ДЛЯ ROS в A-T путем изменения динамики цитоскелета (т.е. схватки и распространения) как прямой результат активации Rho семьи GTPases в пробирке⁵. В конечномсчете, эти изменения в динамике цитоскелета, вызванные активацией семьи Rho, могут привести к повышенному риску развития метастатического рака, отмеченного у пациентов А-Т^5,13. Таким образом, понимание взаимодействия между клеточными матричными взаимодействиями во время окислительного стресса может дать представление о регуляции слипа и распространения. Эти исследования могут также заложить основу для дальнейших исследований возможной роли семьи Rho GTPases в этих сигнальных процессах.

Описанный в настоящем виде протокол для изучения ранней клеточной динамики сборки адгезии и распространения во время окислительного стресса, вызванного ингибированием активности киназы АТМ. Этот анализ основан на хорошо охарактеризованном механизме крепления якорно-зависимых клеток к фибронектину белка ECM (FN). Когда клетки, поддерживаемые в подвеске, покрываются на FN, несколько Rho GTPases координируют контроль актина цитоскелета ремоделирования^3,14. Морфологические изменения наблюдаются по мере того, как клетки переходят от круглых и круговых по внешнему виду к сплющенному и расширенному. Одновременно с этими наблюдениями происходит разработка многочисленных матричных спаек с ECM. Эти изменения связаны с двухфамной активации RhoA с Rac1 в течение первого часа, как клетки придерживаются и ^{распространяются 15,16}.

Различные методы были использованы для изучения морфологии адгезии и динамики, а также распространение клеток. Тем не менее, эти методы опираются на сложные долгосрочные, живой визуализации общего внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) или конфокальной микроскопии систем. Таким образом, пользователи должны иметь доступ к специализированному оборудованию и программному обеспечению. Кроме того, время настройки, требуемое этими био-изображениясистемделает захват ранних событий сцепения сложной задачей, особенно при одновременном тестировании нескольких ингибиторов или условий лечения.

Методы, детализированные, в настоящем ива, обеспечивают простой, экономичный, но количественный способ оценки параметров, которые регулируют сборку стыковки и распространения в пробирке. Протокол выполняется с использованием широко доступного лабораторного оборудования, например, эпифлюоресцентного микроскопа и CCD-камеры. Этот анализ включает в себя применение якорно-зависимых клеток к FN покрытием поверхности после периода окислительного стресса, вызванного химическим ингибированием активности киназы АТМ, которая была продемонстрирована ранее⁵. После покрытия, клетки могут прикрепляться и придерживаться в течение определенного периода времени. Непривязанные клетки смываются, в то время как прикрепленные клетки фиксируются и маркируются антителами на основе флуоресценции к маркерам адгезии (например, паксиллин) и распространяются (например, F-актин)^2,5. Эти белки затем визуализированы и записаны с помощью эпифлюоресцентного микроскопа. Последующий анализ данных проводится с использованием свободно доступного программного обеспечения Фиджи. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для изучения динамики адгезии в широком диапазоне условий, включая различные белки ECM, лечение различными условиями окислителей/клеточной культуры или различных якорно-зависимых клеточных линий для решения широкого спектра биологические вопросы.