Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

Aderências de matriz celular (ou seja, aderências focais) são grandes e dinâmicos complexos proteicos multimoleculares que mediam a adesão e disseminação celular. Estes processos são críticos para o desenvolvimento do tecido, a manutenção, e a função physiological. As aderências focais são compostas de receptores ligados à membrana, como as integrinas, bem como as proteínas de andaimes que ligam a actina citoesquelética à matriz extracelular (ECM)¹. Esses complexos são capazes de responder a pistas fisioquímicas presentes no ambiente extracelular através da ativação de várias vias de transdução de sinalização. Como tal, as aderências focais servem como centros de sinalização para propagar pistas mecânicas extracelulares em vários processos celulares, incluindo migração^{direcionada, regulação}do ciclo celular, diferenciação e sobrevida^1,2. Um grupo de moléculas de sinalização que regulam e interagem com aderências focais inclui membros da família Rho de pequenos GTPases. As GTPases Rho são proteínas-chave que regulam a migração celular e a dinâmica de aderência através de sua ativação espaciotemporal específica³. Não surpreendentemente, a desregulação da função da proteína Rho tem sido implicada em um número de patologias humanas, tais como metástases, angiogênese, e outros. De particular interesse, o status redox celular desempenha um papel predominante na modulação da migração celular e adesão. Alterações na homeostase redox, como aumentos de espécies reativas de oxigênio (ROS), têm sido demonstradas para regular a atividade protéica de Rho, bem como adesão, em um número de tipos de células e doenças humanas^{4,5,6 ,7,8}. Por exemplo, indivíduos que sofrem da desordem neurológica ataxia-Telangiectasia (A-T), que é causada por uma mutação no reparo de danos de DNA serina/treonina quinase A-T-Mutated (ATM), têm um risco aumentado de câncer metastático^9, a ¹⁰. A perda da atividade da quinase ATM nesses pacientes e linhagens celulares, seja por meio da mutação genética ou da inibição química, resulta em altos níveis de estresse oxidativo devido à disfunção da via de fosfato pentose^{7,11, doze anos}. Além disso, os estudos recentes do laboratório destacaram um papel patofisiológico para ROS em A-T alterando a dinâmica do cytoesquelético (isto é. adesão e espalhar) como um resultado direto de ativar GTPases da família de Rho in vitro⁵. Em última análise, essas alterações na dinâmica citoesquelética causadas pela ativação da família Rho podem levar ao aumento do risco de câncer metastático observado em pacientes com A-T^5,13. Portanto, compreender a interação entre as interações célula-matriz durante o estresse oxidativo pode fornecer insights sobre a regulação da adesão e disseminação. Estes estudos podem igualmente ajustar o estágio para umas investigações mais adicionais em um papel possível para GTPases da família de Rho nestes processos de sinalização.

Descrito aqui é um protocolo para estudar a dinâmica celular precoce do conjunto de aderência e disseminação durante o estresse oxidativo causado pela inibição da atividade da quinase ATM. Este ensaio baseia-se no mecanismo bem caracterizado de adesão de células dependentes de ancoragem à fibronectina de proteína ECM (FN). Quando as células mantidas em suspensão são chapeadas na FN, vários Rho GTPases coordenam o controle^{do remodelamento}citoesquelético de actina^14,15. Alterações morfológicas são observadas à medida que as células mudam de volta e circulares na aparência para achatado e expandido. Concomitante com estas observações é o desenvolvimento de aderências numerosas da matriz com o ECM. Essas alterações são atribuídas à ativação bifásica de Rhoa com Rac1 durante a primeira hora em que as células aderem e se espalham ^15,16.

Uma variedade de métodos tem sido utilizada para examinar a morfologia da adesão e dinâmica, bem como a propagação celular. No entanto, esses métodos dependem de sistemas sofisticados de fluorescência de reflexão interna (TIRF) ou de microscopia confocal de longo prazo e de imagem viva. Assim, os usuários devem ter acesso a equipamentos e softwares especializados. Além disso, o tempo de set-up exigido por esses sistemas de bioimagem torna a captura de eventos de adesão precoce desafiador, especialmente quando o teste de múltiplos inibidores ou condições de tratamento simultaneamente.

Os métodos detalhados, aqui, fornecem uma maneira direta, econômica, contudo quantitativa de avaliar os parâmetros que governam o conjunto da adesão e que espalham in vitro. O protocolo é realizado usando equipamentos laboratoriais comumente disponíveis, como um microscópio de epifluorescência e câmera CCD. Este ensaio envolve a aplicação de células dependentes de ancoragem a uma superfície revestida com FN após um período de estresse oxidativo causado pela inibição química da atividade da quinase ATM, que tem sido demonstrada anteriormente⁵. Após o chapeamento, as células são permitidas para anexar e aderir para comprimentos especificados de tempo. As células não anexadas são lavadas, enquanto as células anexadas são fixas e marcadas com anticorpos à base de fluorescência para marcadores de aderência (por exemplo, paxillin) e espalhamento (por exemplo, F-Actina)^2,5. Essas proteínas são então visualizadas e gravadas usando um microscópio de epifluorescência. A análise de dados subseqüente é executada usando o software livremente disponível de Fiji. Além disso, este método pode ser adaptado para examinar a dinâmica de adesão uma ampla gama de condições, incluindo diferentes proteínas de ECM, tratamento com vários oxidantes/condições de cultura celular ou uma variedade de linhas celulares dependentes de ancoragem para abordar uma ampla gama de questões biológicas.