Esame della dinamica dell'adesione cellulare e della diffusione delle cellule epiteliali su fibronectina durante lo stress ossidativo

Le adeguarzioni cellula-matrice (ad esempio, le adeguarzioni focali) sono grandi e dinamiche complessi proteici multimolecolari che mediano l’adesione e la diffusione cellulare. Questi processi sono fondamentali per lo sviluppo dei tessuti, la manutenzione e la funzione fisiologica. Le adere focali sono composte da recettori legati alla membrana, come le integrine, così come le proteine dell’impalcatura che collegano l’actina citoscheletrica alla matrice extracellulare (ECM)¹. Questi complessi sono in grado di rispondere ai segnali fisiochimici presenti nell’ambiente extracellulare attraverso l’attivazione di varie vie di trasduzione di segnalazione. Come tale, le adesioni focali servono come centri di segnalazione per propagare segnali meccanici extracellulari in una serie di processi cellulari tra cui la migrazione diretta, la regolazione del ciclo cellulare, la differenziazione e la sopravvivenza^1,2. Un gruppo di molecole di segnalazione che regolano e interagiscono con le ademioni focali includono membri della famiglia Rho di piccole GTPases. Rho GTPases sono proteine chiave che regolano la migrazione cellulare e la dinamica di adesione attraverso la loro specifica attivazione spatiotemporale³. Non sorprendentemente, la disregolazione della funzione della proteina Rho è stata implicata in una serie di patologie umane come metastasi, angiogenesi e altri. Di particolare interesse, lo stato di redox cellulare svolge un ruolo predominante nella modulazione della migrazione cellulare e dell’adesione. Sono state dimostrate alterazioni nell’omeostasi redox, come l’aumento delle specie reattive dell’ossigeno (ROS), per regolare l’attività della proteina Rho, così come l’adesione, in un certo numero di tipi di cellule e malattie umane^{4,5,6 ,7,8}. Ad esempio, gli individui affetti dal disturbo neurologico ataxia-telangiectasia (A-T), che è causato da una mutazione del danno del DNA riparare serina / trenina chinasi A-T-mutato (ATM), hanno un aumentato rischio di cancro metastatico^{9, 10}. La perdita di attività della chinasi ATM in questi pazienti e linee cellulari, sia per mutazione genetica che per inibizione chimica, si traduce in alti livelli di stress ossidativo a causa della disfunzione del percorso del fosfato pentozoico^{7,11, 12}. Inoltre, recenti studi del laboratorio hanno evidenziato un ruolo patofisiologico per ROS in A-T alterando la dinamica citoscheletrica (ad esempio adesione e diffusione) come risultato diretto dell’attivazione di Rho family GTPases in vitro⁵. In definitiva, queste alterazioni nelle dinamiche citoscheletriche causate dall’attivazione della famiglia Rho possono portare all’aumento del rischio di cancro metastatico osservato nei pazienti A-T^5,13. Pertanto, comprendere l’interazione tra le interazioni cellula-matrice durante lo stress ossidativo può fornire informazioni sulla regolazione dell’adesione e della diffusione. Questi studi possono anche mettere in stadio per ulteriori indagini su un possibile ruolo per la famiglia Rho GTPases in questi processi di segnalazione.

Descritto qui è un protocollo per studiare la dinamica cellulare precoce dell’assemblaggio dell’adesione e della diffusione durante lo stress ossidativo causato dall’inibizione dell’attività della chinasi ATM. Questo test si basa sul meccanismo ben caratterizzato dell’adesione delle cellule dipendenti dall’ancoraggio alla fibroctina della proteina ECM (FN). Quando le cellule mantenute in sospensione sono placcate su FN, diversi Rho GTPases coordinano il controllo dell’actin citoskeletal rimodellamento^3,14. I cambiamenti morfologici si osservano quando le cellule si spostano da rotonde e circolari nell’aspetto a appiattite ed espanse. Concomitanti con queste osservazioni è lo sviluppo di numerose adeguarsi matrice con l’ECM. Questi cambiamenti sono attribuiti all’attivazione bifasica di RhoA con Rac1 durante la prima ora man mano che le cellule aderiscono e si diffondono ^15,16.

Una varietà di metodi sono stati utilizzati per esaminare la morfologia e la dinamica dell’adesione, nonché la diffusione delle cellule. Tuttavia, questi metodi si basano su sofisticati sistemi di microscopia a lunga e lunga durata, a immagine reale di riflessione interna (TIRF) o microscopia confocale. Pertanto, gli utenti devono avere accesso a apparecchiature e software specializzati. Inoltre, il tempo di creazione richiesto da questi sistemi di bio-imaging rende difficile l’acquisizione di eventi di adesione precoce, soprattutto quando si testano più inibitori o condizioni di trattamento contemporaneamente.

I metodi descritti, nel presente documento, forniscono un modo semplice, economico, ma quantitativo per valutare i parametri che regolano l’assemblaggio dell’adesione e la diffusione in vitro. Il protocollo viene eseguito utilizzando apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, come un microscopio a epifluorescenza e una telecamera CCD. Questo saggio prevede l’applicazione di cellule dipendenti dall’ancoraggio a una superficie rivestita con FN dopo un periodo di stress ossidativo causato dall’inibizione chimica dell’attività della chinasi ATM, che è stato dimostrato in precedenza⁵. Dopo la placcatura, le cellule possono attaccare e aderire per periodi di tempo specificati. Le cellule non attaccate vengono lavate via, mentre le cellule attaccate sono fisse ed etichettate con anticorpi basati sulla fluorescenza ai marcatori di adesione (ad esempio, paxillin) e diffusione (ad esempio, F-actin)^2,5. Queste proteine vengono quindi visualizzate e registrate utilizzando un microscopio a epifluorescenza. L’analisi dei dati successiva viene eseguita utilizzando il software Fiji liberamente disponibile. Inoltre, questo metodo può essere adattato per esaminare le dinamiche di adesione in una vasta gamma di condizioni, tra cui diverse proteine ECM, il trattamento con vari ossidanti / condizioni di coltura cellulare o una varietà di linee cellulari dipendenti dall’ancoraggio per affrontare un’ampia gamma di domande biologiche.