בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

הידקויות תא מטריצות (כלומר, הידקויות מוקד) הן מכלולי חלבון רב ודינאמיים מרובי-מולקולרית, אשר מתווכים בין הדבקה והפצת תאים. תהליכים אלה קריטיים לפיתוח רקמות, תחזוקה ותפקוד פיזיולוגי. הידקויות מיקוד מורכבים קולטנים מאוגדים ממברנה, כגון אינטנס, כמו גם הפיגומים חלבונים המקשרים אקטין השלד בתוך מטריצה החילוץ (ecm)¹. מתחמי אלה מסוגלים להגיב לרמזים פיזיוכימיים נוכח בסביבה המומנת באמצעות הפעלה של שבילים איתות שונים התמרה. ככזה, הידקויות מיקוד לשמש מרכזי איתות כדי להפיץ רמזים מכניים לתוך מספר תהליכים סלולריים כולל הגירה מכוונת, רגולציה מחזור התא, בידול, והישרדות^1,2. קבוצה אחת של מולקולות איתות המווסת ומאינטראקציה עם הידקויות מוקד כוללות חברים של משפחת Rho של GTPases קטנים. Rho GTPases הם חלבונים מרכזיים המסדירים את הגירה התא ואת הדינמיקה הדבקה דרך ההפעלה הטמפורלית הספציפית שלהם³. לא באופן מפתיע, דיסתקנה של תפקוד החלבון של רו היתה מעורב במספר הפתווגיות אנושיות כגון גרורות, אנגיוגנזה, ועוד. מעניין מיוחד, מעמד הסלולר התאי משחק תפקיד דומיננטי באפנון של הגירה תא והדבקה. שינויים ב הומאוסטזיס, כגון הגדלת מינים חמצן תגובתי (ROS), הוכחו להסדיר פעילות חלבון Rho, כמו גם הדבקה, במספר סוגי תאים ומחלות אדם^{4,5,6 ,7,8}. לדוגמה, אנשים הסובלים הפרעת נוירולוגיות אטקסיה telangiectasia (A-T), אשר נגרמת על ידי מוטציה בתיקון הנזק DNA סרין/טראונין קינאז A-T-מוטציה (ATM), יש סיכון מוגבר של סרטן גרורתי^9, . בסדר, ^עשר הפסד של פעילות ATM קינאז בחולים אלה קווי תאים, או באמצעות מוטציה גנטית או עיכוב כימי, תוצאות רמות גבוהות של מתח חמצוני עקב חוסר תפקוד של מסלול פוספט^{פנז 7,11,} . ^{שתיים עשרה} יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה מן המעבדה הדגישו תפקיד פתופסולוגי עבור ROS ב-T על ידי שינוי דינמיקה השלד הציטומי (כלומר הדבקה והתפשטות) כתוצאה ישירה של הפעלת GTPases משפחת רו ב מבחנה⁵. בסופו של דבר, שינויים אלה הדינמיקה השלד ציטומי נגרמת על ידי הפעלת משפחת Rho עלול להוביל לסיכון מוגבר של סרטן גרורתי ציין בחולים^5,13. לכן, הבנת הגומלין בין אינטראקציות תא מטריקס במהלך לחץ חמצוני יכולה לספק תובנות לגבי התקנה של הדבקה והתפשטות. מחקרים אלה יכולים גם להגדיר את הבמה לחקירה נוספת לתפקיד אפשרי עבור משפחת Rho GTPases בתהליכים אלה איתות.

מתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את הדינמיקה התאית המוקדמת של הרכבה הדבקה והתפשטות במהלך לחץ חמצוני הנגרמת על ידי עיכוב של פעילות ATM קינאז. שיטת הפעולה מבוססת על המנגנון המאופיין היטב של תאים התלויים באנקורג ‘ לחלבון ה-ecbronectin (FN). כאשר התאים הנשמרים ההשעיה מצופים FN, מספר רו gtpases לתאם את השליטה של שיפוץ אקטין השלד שיפוצים^3,14. שינויים מורפולוגיים נצפו כאשר התאים משתנים מעגול ועגול במראה לשיטוח ולהרחבה. במקביל עם תצפיות אלה הוא התפתחות של הידקויות רבות של מטריקס עם ECM. שינויים אלה מיוחסים להפעלת biphasic של rhoa עם Rac1 בשעה הראשונה כמו תאים לדבוק ולהתפשט ^15,16.

נעשה שימוש במגוון שיטות לבדיקת מורפולוגיה ודינמיקה של התאים והתפשטות התא. עם זאת, שיטות אלה מסתמכות על השתקפות מתוחכמת ארוכת טווח לאורך זמן, הדמיה פנימית (TIRF) או מערכות המיקרוסקופיה. לפיכך, על המשתמשים להיות בעלי גישה לציוד ולתוכנה מיוחדים. יתר על כן, זמן הגדרת הנדרש על ידי אלה הדמיה מערכות ביולוגי עושה לכידת אירועים הדבקה מוקדם מאתגרת, במיוחד בעת בדיקת מעכבי מרובים או תנאי טיפול במקביל.

השיטות המפורטות, להלן, מספקות דרך ישירה, חסכונית, אך כמותית, להעריך את הפרמטרים השולטים בהרכבת הדבקה ובהפצת מבחנה. הפרוטוקול מבוצע באמצעות ציוד מעבדה זמין בדרך כלל, כגון מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית מצלמת CCD. שיטת הפעולה כרוכה בהחלת תאים התלויים באנקורג ‘ למשטח FN-מצופה לאחר תקופה של מתח חמצוני הנגרם על ידי עיכוב כימי של פעילות ATM קינאז, אשר הפגינו בעבר⁵. לאחר הציפוי, תאים מורשים לצרף ולדבוק לאורך הזמן שצוין. תאים שאינם מצורפים נשטפים, בעוד התאים המחוברים הם קבועים ומסומנים עם נוגדנים מבוססי פלואורסצנטית סמנים של הדבקה (למשל, פקעבלין) ומתפשטת (למשל, F-actin)^2,5. חלבונים אלה הם דמיינו ונרשמו באמצעות מיקרוסקופ אפיפייתי. ניתוח הנתונים הבאים מבוצע באמצעות תוכנת פיג’י זמינה בחופשיות. כמו-כן, ניתן להתאים שיטה זו לבדיקת דינמיקת הדבקה תחת מגוון רחב של תנאים, לרבות חלבונים מסוג ECM שונים, טיפול במספר רב של מצבים של חמצון/התרבות התאית או מגוון קווים תלויי-עגינה הקשורים למגוון רחב של שאלות ביולוגיות.