Examiner la dynamique de l'adhérence cellulaire et la propagation des cellules épithéliales sur la fibronectine pendant le stress oxydatif

Les adhérences de matrice cellulaire (c.-à-d. les adhérences focales) sont de grands et dynamiques complexes de protéines multimoléculaires qui entravent l’adhérence cellulaire et la propagation. Ces processus sont essentiels pour le développement, l’entretien et la fonction physiologique des tissus. Les adhérences focales sont composées de récepteurs liés à la membrane, tels que les intégrines, ainsi que de protéines d’échafaudage qui relient l’actine cytosquelettique à la matrice extracellulaire (ECM)¹. Ces complexes sont capables de répondre aux indices physiochimiques présents dans l’environnement extracellulaire grâce à l’activation de diverses voies de transduction de signalisation. En tant que tel, les adhérences focales servent de centres de signalisation pour propager des indices mécaniques extracellulaires dans un certain nombre de processus cellulaires, y compris la migration dirigée, la régulation du cycle cellulaire, la différenciation, et la survie^1,2. Un groupe de molécules de signalisation qui régulent et interagissent avec les adhérences focales comprend des membres de la famille Rho de petits GTPases. Les Rho GTPases sont des protéines clés qui régulent la migration cellulaire et la dynamique d’adhérence grâce à leur activation spatiotemporale spécifique³. Sans surprise, la dysrégulation de la fonction de protéine de Rho a été impliquée dans un certain nombre de pathologies humaines telles que la métastes, l’angiogenèse, et d’autres. D’intérêt particulier, le statut de redox cellulaire joue un rôle prédominant dans la modulation de la migration cellulaire et de l’adhérence. Des altérations de l’homéostasie redox, telles que l’augmentation des espèces réactives d’oxygène (ROS), ont été démontrées pour réguler l’activité de protéine de Rho, aussi bien que l’adhérence, dans un certain nombre de types de cellules et de maladies humaines^{4,5,6 ,7,8}. Par exemple, les personnes souffrant du trouble neurologique ataxie-telangiectasia (A-T), qui est causée par une mutation dans la réparation des dommages à l’ADN serine / thréonine kinase A-T-mutated (ATM), ont un risque accru de cancer métastatique^{9, 10}. La perte de l’activité de kinase d’ATM dans ces patients et lignes cellulaires, par la mutation génétique ou l’inhibition chimique, a comme conséquence des niveaux élevés de stress oxydatif dû au dysfonctionnement de la voie^dephosphate de pentose 7^{,11, 12}. En outre, des études récentes du laboratoire ont mis en évidence un rôle pathophysiologique pour ROS dans A-T en modifiant la dynamique cytosquelettique (c.-à-d. l’adhérence et la propagation) comme résultat direct de l’activation de la famille Rho GTPases in vitro⁵. En fin decompte, ces altérations de la dynamique cytosquelettique causée par l’activation de la famille Rho peuvent conduire à un risque accru de cancer métastatique noté chez les patients A-T^5,13. Par conséquent, la compréhension de l’interaction entre les interactions cellule-matrice pendant le stress oxydatif peut fournir un aperçu de la régulation de l’adhérence et de la propagation. Ces études peuvent également préparer le terrain pour d’autres investigations sur un rôle possible pour la famille Rho GTPases dans ces processus de signalisation.

Décrit ci-dessus est un protocole pour étudier la dynamique cellulaire tôt de l’assemblage d’adhérence et de se propageant pendant l’effort oxydant provoqué par l’inhibition de l’activité de kinase d’ATM. Cet assay est basé sur le mécanisme bien caractérisé de l’adhérence des cellules dépendantes de l’ancrage à la fibronectine de protéine d’ECM (FN). Lorsque les cellules maintenues en suspension sont plaquées sur FN, plusieurs Rho GTPases coordonnent le contrôle de l’actine cytosquelettique^3,14. Des changements morphologiques sont observés à mesure que les cellules passent de l’apparence ronde et circulaire à l’aplatiet et à l’expansion. En même temps que ces observations, il y a le développement de nombreuses adhérences matricielles avec l’ECM. Ces changements sont attribués à l’activation biphasique de RhoA avec Rac1 pendant la première heure que les cellules adhèrent et se propagent ^15,16.

Une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner la morphologie et la dynamique de l’adhérence ainsi que la propagation cellulaire. Cependant, ces méthodes s’appuient sur des systèmes sophistiqués de fluorescence interne totale à long terme (TIRF) ou de microscopie confocale. Ainsi, les utilisateurs doivent avoir accès à de l’équipement et à des logiciels spécialisés. En outre, le temps d’configuration requis par ces systèmes de bio-imagerie rend la capture des événements d’adhérence précoce difficile, en particulier lors de l’essai de plusieurs inhibiteurs ou des conditions de traitement en même temps.

Les méthodes détaillées, ici, fournissent un moyen simple, économique, mais quantitatif pour évaluer les paramètres qui régissent l’assemblage d’adhérence et la propagation in vitro. Le protocole est exécuté à l’aide d’équipement de laboratoire couramment disponible, comme un microscope épifluorescence et une caméra CCD. Cet analyse consiste à appliquer des cellules dépendantes de l’ancrage à une surface enduite de FN après une période de stress oxydatif causée par l’inhibition chimique de l’activité kinase ATM, qui a été démontrée précédemment⁵. Après le placage, les cellules sont autorisées à se fixer et à adhérer pendant des durées déterminées. Les cellules non attachées sont lavées, tandis que les cellules attachées sont fixées et étiquetées avec des anticorps à base de fluorescence aux marqueurs d’adhérence (p. ex. de paxillin) et de propagation (p. ex., F-actin)^2,5. Ces protéines sont ensuite visualisées et enregistrées à l’aide d’un microscope à épifluorescence. L’analyse ultérieure des données est effectuée à l’aide du logiciel Fidji disponible gratuitement. En outre, cette méthode peut être adaptée pour examiner la dynamique d’adhérence dans un large éventail de conditions, y compris différentes protéines ECM, le traitement avec diverses conditions d’oxydants/culture cellulaire ou une variété de lignées cellulaires dépendantes de l’ancrage pour répondre à un large éventail de questions biologiques.