Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

Celmatrix verklevingen (d.w.z. focale verklevingen) zijn grote en dynamische multimoleculaire proteïne-complexen die de hechting en verspreiding van cellen bemedieren. Deze processen zijn essentieel voor weefsel ontwikkeling, onderhoud en fysiologische functie. Focale verklevingen zijn samengesteld uit membraan-gebonden receptoren, zoals integrinen, evenals steigers eiwitten die cytoskelet actine koppelen aan de extracellulaire matrix (ECM)¹. Deze complexen zijn in staat om te reageren op fysiochemische signalen die aanwezig zijn in de extracellulaire omgeving door het activeren van verschillende signalering transductie trajecten. Als zodanig, focale adhesies dienen als signalering centra te propageren extracellulaire mechanische aanwijzingen in een aantal cellulaire processen, met inbegrip van gerichte migratie, celcyclus regulering, differentiatie, en overleving^1,2. Een groep van signalering moleculen die reguleren en interactie met focale adhesies omvat leden van de familie van de Rho van kleine GTPases. Rho GTPases zijn belangrijke eiwitten die de Celmigratie en adhesie dynamiek reguleren via hun specifieke spatiotemporele activatie³. Niet verrassend, disregulatie van de Rho eiwit functie is betrokken bij een aantal menselijke pathologieën zoals metastase, angiogenese, en anderen. Van bijzonder belang, cellulaire redox status speelt een overheersende rol in de modulatie van de Celmigratie en adhesie. Veranderingen in redox homeostase, zoals stijgingen van de reactieve zuurstof soorten (Ros), zijn aangetoond dat het reguleren van de Rho-eiwit activiteit, evenals adhesie, in een aantal celtypen en menselijke ziekten^{4,5,6 ,7,8}. Bijvoorbeeld, personen die lijden aan de neurologische aandoening ataxie-Telangiectasia (A-T), die wordt veroorzaakt door een mutatie in de DNA-schade herstel serine/Threonine kinase A-T-gemuleerd (ATM), hebben een verhoogd risico op gemetastaseerde kanker^{9, 10}. Verlies van ATM kinase activiteit bij deze patiënten en cellijnen, hetzij door genetische mutatie of chemische remming, resulteert in hoge niveaus van oxidatieve stress als gevolg van disfunctie van de pentose fosfaat pathway^{7,11, 12}. Bovendien hebben recente studies van het laboratorium een pathofysiologische rol voor ROS in A-T belicht door de cytoskelet dynamiek (d.w.z. adhesie en verspreiding) te veranderen als een direct gevolg van het activeren van de Rho familie GTPases in vitro⁵. Uiteindelijkkunnen deze veranderingen in de cytoskelet dynamiek veroorzaakt door de activering van de familie Rho leiden tot het verhoogde risico van gemetastaseerde kanker bij A-T patiënten^5,13. Daarom kan het begrijpen van het samenspel tussen celmatrix interacties tijdens oxidatieve stress inzicht geven in de regulering van adhesie en verspreiding. Deze studies kunnen ook het podium voor verdere onderzoeken naar een mogelijke rol voor Rho familie GTPases in deze signalering processen.

Hierin beschreven is een protocol voor het bestuderen van de vroege cellulaire dynamiek van adhesie assemblage en verspreiding tijdens oxidatieve stress veroorzaakt door remming van ATM kinase activiteit. Deze test is gebaseerd op het goed gekarakteriseerde mechanisme van verankerings afhankelijke cellen adhesie aan het ECM-eiwit fibronectine (FN). Wanneer cellen in suspensie worden geplateerd op FN, coördineren verschillende Rho gtpases de controle van de actine cytoskelet remodellering^3,14. Morfologische veranderingen worden waargenomen als cellen verschuiven van ronde en cirkelvormig in uiterlijk tot afgevlakt en uitgevouwen. Gelijktijdig met deze waarnemingen is de ontwikkeling van talrijke matrix verklevingen met de ECM. Deze veranderingen worden toegeschreven aan de bifasische activering van rhoa met Rac1 tijdens het eerste uur als cellen zich hechten en verspreiden ^15,16.

Een verscheidenheid van methoden zijn gebruikt voor het onderzoeken van adhesie morfologie en dynamiek, alsmede de verspreiding van cellen. Deze methoden zijn echter gebaseerd op geavanceerde, op lange termijn, Live-Imaging totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) of confocale microscopie systemen. Gebruikers moeten dus toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur en software. Bovendien maakt de set-up tijd die nodig is voor deze bio-imagingsystemen het vastleggen van vroege adhesie gebeurtenissen uitdagend, vooral bij het testen van meerdere remmers of behandelings condities gelijktijdig.

De hier beschreven methoden bieden een eenvoudige, economische en toch kwantitatieve manier om parameters te beoordelen die de adhesie-assemblage beheersen en in vitro verspreiden. Het protocol wordt uitgevoerd met behulp van algemeen beschikbare laboratoriumapparatuur, zoals een epifluorescentie-Microscoop en een CCD-camera. Deze bepaling omvat het toepassen van verankerings afhankelijke cellen op een oppervlak met FN-coating na een periode van oxidatieve stress veroorzaakt door chemische remming van ATM kinase activiteit, die eerder is aangetoond⁵. Na het bekleden zijn cellen toegestaan om te hechten en zich te hechten voor gespecificeerde lengtes van tijd. Niet-bevestigde cellen worden weggespoeld, terwijl de bijgevoegde cellen zijn bevestigd en geëtiketteerd met fluorescentie-antilichamen tegen markers van hechting (bijv. paxiline) en verspreiden (^{bijv. F}-actin)^2,5. Deze eiwitten worden vervolgens gevisualiseerd en opgenomen met behulp van een epifluorescentie Microscoop. Daaropvolgende data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van gratis beschikbare Fiji-software. Bovendien kan deze methode worden aangepast om de adhesie dynamiek onder een breed scala aan omstandigheden te onderzoeken, waaronder verschillende ECM-eiwitten, behandeling met verschillende oxidanten/celkweek omstandigheden of een verscheidenheid aan verankerings afhankelijke cellijnen om een breed scala aan biologische vragen.