Et antistoff fôring tilnærming til studier glutamat reseptor smugling i dissosiert primær hippocampus kulturer

Celler utnytte den aktive prosessen med menneskehandel å mobilisere proteiner til bestemte subcellulære lokaliseringer og utøve streng spatiotemporal regulering over deres funksjon¹. Denne prosessen er spesielt viktig for transmembrane reseptorer, som cellulære svar på ulike miljømessige stimuli stole på intracellulære kaskader utløst av reseptor aktivering. Celler er i stand til å endre disse svarene ved å endre tettheten, lokalisering, og delenhet sammensetning av reseptorer uttrykt på celleoverflaten via reseptor subcellulære smugling regulering². Innsetting av nylig synthetized reseptorer i plasma membranen, sammen med endocytose og resirkulering av eksisterende reseptorer er eksempler på menneskehandel prosesser som bestemmer netto pool av overflate-uttrykt reseptorer². Mange molekylære mekanismer samarbeider for å regulere protein smugling, inkludert protein-protein interaksjoner og posttranslational modifikasjoner som fosforylering, ubiqitinering, eller palmitoylation².

Regulering av reseptor smugling er spesielt nødvendig i sterkt polarisert celler med høyt spesialiserte strukturer. Paradigmatiske eksempel er kontroll av neuronal funksjon av regulert smugling av glutamat reseptorer (GluRs)^3,4. Glutamat, den viktigste eksitatoriske signalstoff, binder og aktiverer overflate-uttrykt GluRs å kontrollere fundamentale fysiologiske neuronal funksjoner som Synaptic neurotransmission og Synaptic plastisitet. Det faktum at endret GluR smugling har blitt observert i et bredt spekter av nevropatier, alt fra neurodevelopmental lidelser til nevrodegenerative sykdommer, fremhever viktigheten av denne prosessen⁵. Dermed forstå den molekylære hendelser som kontrollerer GluR smugling er av interesse i mange områder av forskningen.

I denne protokollen brukes et antistoff-basert metode for å kvantifisere nivået av overflaten-uttrykt GluRs i primære hippocampus neurons samt vurdere hvordan endringer i internalisering og resirkulering resultere i observert netto overflate uttrykk. Bruk av farmakologi og/eller overuttrykte av eksogene reseptorer harboring spesifikke mutasjoner gjør denne protokollen en spesielt kraftfull tilnærming for å studere molekylære mekanismer underliggende neuronal tilpasning til ulike miljømessige stimuli. Et siste eksempel på nytten av denne protokollen er å studere hvordan multifaktoriell endringer i miljøet (for eksempel i en sykdom modeller) påvirker GluR smugling gjennom undersøkelse av overflate uttrykk i slike modeller.

Ved hjelp av konkrete eksempler, er det i utgangspunktet demonstrert hvordan en Pharmacologic manipulasjon etterligne fysiologiske Synaptic stimulering [kjemiske LTP (cLTP)] øker overflaten uttrykk for den endogene GluA1 delenhet av AMPA-type GluRs (AMPARs) ⁶. smugling av en overexpressed fosfat-mimetisk form av GluN2B delenhet av NMDA-type GluRs (NMDARs) er også analysert for å eksempler på hvordan denne protokollen kan brukes til å studere regulering av GluR smugling av bestemte posttranslational Endringer. Selv om disse konkrete eksemplene brukes, kan denne protokollen enkelt brukes på andre GluRs og andre reseptorer og proteiner som besitter antigen ekstracellulære domener. I tilfelle at det ikke er antistoffer tilgjengelig for ekstracellulære domener, overuttrykte av ekstracellulære epitope-merket (for eksempel Flag-, myC-, GFP-Tagged, etc.) proteiner kan bistå i protein merking.

Den gjeldende protokollen gir instruksjoner for kvantifisere spesifikk GluR under type tetthet og smugling ved hjelp av spesifikke antistoffer. Denne protokollen kan benyttes til å studere 1) totalt GluR overflate uttrykk, 2) GluR internalisering, og 3) GluR resirkulering. For å studere hver enkelt prosess individuelt, anbefales det å begynne med avsnitt 1 og 2 og fortsette med enten del 3, 4 eller 5. I alle tilfeller, avslutt med avsnittene 6 og 8 (figur 1).