Лентивирный CRISPR/Cas9-Опосредованный геном Редактирование для изучения гематоподетические клетки в модели болезней
Summary
Описаны протоколы для высокоэффективного редактирования генома гематопоатического стебля и клеток-прародителей (HSPC) системой CRISPR/Cas9 для быстрого развития систем мышиной модели с гематопоиетической системой конкретных модификаций генов.
Abstract
Манипулирование генами в гематопоитических стволовых клетках с использованием традиционных подходов к трансгенезу может быть трудоемким, дорогостоящим и сложным. Извлекая выгоду из достижений в технологии редактирования генома и опосредованных трансгенных систем трансгена, здесь описан эффективный и экономичный метод, который устанавливает мышей, в которых гены манипулируются именно в гематопоитических стволовых клетках. Лентивирусы используются для преобразовывания Cas9-выражения линии отрицательных клеток костного мозга с руководством РНК (gRNA) ориентации конкретных генов и красный ген репортера флуоресценции (RFP), то эти клетки пересаживаются в смертельно облученных C57BL/6 мышей. Мыши, пересаженные с лентивирусом, выражающим нецелевую гРНК, используются в качестве средств контроля. Прививка трансумированных гематопоиетических стволовых клеток оценивается по течению цитометрического анализа ППП-положительных лейкоцитов периферической крови. Используя этот метод, 90% трансдукции миелоидных клеток и 70% лимфоидных клеток в течение 4 недель после трансплантации может быть достигнуто. Геномная ДНК изолирована от RFP-положительных кровяных клеток, и части целевого участка ДНК усиливаются ПЦР для проверки редактирования генома. Этот протокол обеспечивает высокую пропускную стоимость генов гематопойеза и может быть распространен на различные модели заболеваний мышей с участием гематопоитических клеток.
Introduction
Многие исследования в области гематологии и иммунологии полагаются на наличие генетически модифицированных мышей, в том числе обычных и условных трансгенных / нокаут мышей, которые используют гематопоиетической системы конкретных Cre драйверов, таких как Mx1-Cre, Vav-Cre, и другие 1,2,3,4,5. Эти стратегии требуют создания новых штаммов мыши, которые могут быть трудоемкими и финансово обременительными. В то время как революционные достижения в технологии редактирования генома позволили генерации новых штаммов мыши всего за 3-4 месяца с соответствующими техническими знаниями6,7,8,9 , гораздо больше времени требуется, чтобы усилить колонию мыши, прежде чем эксперименты проводятся. Кроме того, эти процедуры являются дорогостоящими. Например, в Jackson Laboratory указана текущая цена услуг по генерации выбивачий мышей в $16 845 за штамм (по состоянию на декабрь 2018 года). Таким образом, более выгодными являются более экономичные и эффективные методы, чем обычные трансгенные подходы мурина.
Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы / CRISPR связанных белков 9 (CRISPR/Cas9) технология привела к разработке новых инструментов для быстрого и эффективного РНК основе, последовательность конкретных редактирования генома. Первоначально обнаруженный как бактериальный адаптивный иммунный механизм для уничтожения вторгающихся патогенных ДНК, система CRISPR/Cas9 была использована в качестве инструмента для повышения эффективности редактирования генома в эукариотических клетках и животных моделях. Для передачи оборудования CRISPR/Cas9 в гематопоитические стволовые клетки (напротив, электропорация, нуклеофекция, липофектация, вирусная доставка и другие) использовался ряд подходов.
Здесь, лентивирусная система используется для преобразовать клетки из-за его способности эффективно заражать Cas9-выражения мурин гематопоиетических стволовых клеток и упаковать вместе руководство РНК экспрессии построить, промоутеры, нормативные последовательности, и гены, которые кодируют флуоресцентные белки репортера (т.е. GFP, RFP). Используя этот метод, ex vivo редактирование гена мыши гематопоатические стволовые клетки была достигнута, а затем успешное восстановление костного мозга в смертельно облученных мышей10. Вектор лентивирусов, используемых для этого исследования выражает Cas9 и GFP репортер генов от общего ядра EF1a промоутер с внутренней рибосомной вступления сайта вверх по течению от гена репортера. Последовательность НАправляющей РНК выражается от отдельного промоутера U6. Эта система затем используется для создания вставки и удаления мутаций в кандидат клональных hematopoiesis драйвер генов Tet2 и Dnmt3a10. Тем не менее, эффективность трансдукции с помощью этого метода является относительно низкой (5%-10%) из-за большого размера векторной вставки (13 Кбит/с), что ограничивает эффективность трансдукции и уменьшает вирус титер во время производства.
В других исследованиях было показано, что больший размер вирусной РНК негативно влияет как на производство вируса, так и на эффективность трансдукции. Например, 1 кб увеличение размера вставки, как сообщается, уменьшить производство вируса на 50%, и эффективность трансдукции снизится до более чем 50% в мыши гематопоитических стволовых клеток11. Таким образом, для повышения эффективности системы выгодно максимально уменьшить размер вирусной вставки.
Этот недостаток можно преодолеть, используя Cas9 трансгенных мышей, в которых белок Cas9 выражается либо в составной или индуцируемой образом12. Составные CRISPR/Cas9 стук-в мышей выражает Cas9 эндонуклеазы и EGFP от промоутера CAG на Rosa26 локус в повсеместной манере. Таким образом, конструкция с sgRNA под контролем промоутера U6 и гена репортера RFP под контролем основного промоутера EF1a может быть доставлена с помощью лентивирусного вектора для достижения редактирования генома. С помощью этой системы, гены гематопоитических стволовых клеток были успешно отредактированы, показывая эффективность трансдукции 90%. Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и эффективный метод создания мышей, в которых целевые генные мутации вводятся в гематопоитической системы. В то время как наша лаборатория в основном использует этот тип технологии для изучения роли клонального гематопоеза в сердечно-сосудистых процессах13,14,15, это также применимо к исследованиям гематологических злокачественности16. Кроме того, этот протокол может быть распространен на анализ того, как мутации ДНК в HSPC влияют на другие заболевания или процессы развития в гематопойтической системе.
Для создания надежной системы вектора лентивирусного вектора необходимы высокие вирусные запасы титра и оптимизированные условия для трансдукции и трансплантации гематопоитических клеток. В протоколе предусмотрены инструкции по подготовке высокотиере вирусного запаса в разделе 1, оптимизации культурных условий гематопоатических стволовых клеток в разделе 2, методах трансплантации костного мозга в разделе 3, а также оценке Прививка в разделе 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимуществом этого протокола является создание моделей животных, укрывающих специфические мутации в гематоподетические клетки быстрым и высокорентабельным образом по сравнению с обычными трансгенными подходами мыши. Было установлено, что эта методология позволяет поколения мышей…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. была поддержана Американской ассоциацией сердца постдокторской стипендий 17POST33670076. К.В. был поддержан грантами NIH R01 HL138014, R01 HL141256 и R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
