Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Muitos estudos em Hematologia e Imunologia dependem da disponibilidade de camundongos geneticamente modificados, incluindo camundongos convencionais e condicionais transgênicos/knock-out que utilizam condutores de CRE específicos do sistema hematopoiéticos, como Mx1-CRE, vav-CRE e outros ^1,2,3,4,5. Essas estratégias exigem o estabelecimento de novas cepas de camundongo, que podem ser demoradas e onerosas financeiramente. Embora os avanços revolucionários na tecnologia de edição de genoma tenham possibilitado a geração de novas cepas de mouse em apenas 3-4 meses com a expertise técnica apropriada^6,7,8,9 , muito mais tempo é exigido para amplificar a colônia do rato antes que os experimentos sejam perseguidos. Além disso, esses procedimentos são dispendiosos. Por exemplo, Jackson Laboratory lista o preço atual dos serviços de geração de ratos knock-out em $16845 por cepa (a partir de dezembro de 2018). Assim, métodos mais econômicos e eficientes do que as abordagens transgênicas murinas convencionais são mais vantajosos.

As repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas/tecnologia CRISPR associada à proteína 9 (CRISPR/Cas9) levaram ao desenvolvimento de novas ferramentas para a edição de genoma rápida e eficiente baseada em RNA, sequência específica. Originalmente descoberto como um mecanismo imunológico adaptativo bacteriano para destruir o DNA do patógeno invasor, o sistema CRISPR/Cas9 tem sido usado como uma ferramenta para aumentar a eficácia da edição do genoma em células eucarióticas e modelos animais. Várias abordagens foram empregadas para a transmissão de máquinas CRISPR/Cas9 em células-tronco hematopoiéticas (i.e., eletroporação, nucleofecção, lipofecção, parto viral e outros).

Aqui, um sistema de Lentivirus é empregado para transduce as células devido à sua capacidade de infectar eficazmente as células tronco hematopoiéticas murinas que expressam a Cas9 e empacotar juntas a construção de expressão de RNA guia, promotores, sequências regulatórias e genes que codificam proteínas de repórter fluorescente (i.e., GFP, RFP). Usando este método, a edição ex vivo do gene de pilhas de haste Hematopoietic do rato foi conseguida, seguida pela reconstituição bem sucedida da medula em ratos letalmente irradiados¹⁰. O vetor do Lentivirus empregado para este estudo expressa os genes do repórter de Cas9 e de GFP do promotor comum do núcleo EF1a com um local ribosomal interno da entrada a montante do gene do repórter. A sequência de RNA guia é expressa a partir de um promotor U6 separado. Este sistema é usado então para criar mutações da inserção e do apagamento nos genes clonal do excitador do hematopoiese do candidato Tet2 e Dnmt3a¹⁰. No entanto, a eficiência de transdução por esse método é relativamente baixa (~ 5%-10%) devido ao grande tamanho da pastilha vetorial (13 kbp) que limita a eficiência de transdução e reduz o titer de vírus durante a produção.

Em outros estudos, demonstrou-se que o maior tamanho do RNA viral afeta negativamente a produção de vírus e a eficiência de transdução. Por exemplo, um aumento de 1 KB no tamanho da pastilha é relatado para diminuir a produção de vírus em ~ 50%, e a eficiência de transdução diminuirá para mais de 50% nas células-tronco hematopoiéticas do mouse¹¹. Assim, é vantajoso para reduzir o tamanho da inserção viral, tanto quanto possível para melhorar a eficiência do sistema.

Essa lacuna pode ser superada empregando-se camundongos transgênicos de CAS9, nos quais a proteína CAS9 é expressa de forma constitutiva ou induzível¹². Os ratos de batida constitutivos de CRISPR/Cas9 expressam o endonuclease Cas9 e o EGFP do promotor de CAG no locus Rosa26 em uma maneira onipresente. Assim, uma construção com sgRNA o controle do promotor U6 e gene repórter RFP o controle do promotor EF1a núcleo pode ser entregue usando o vetor de Lentivirus para alcançar a edição do genoma. Com este sistema, os genes de células-tronco hematopoiéticas foram editados com sucesso, mostrando uma eficiência de transdução de ~ 90%. Assim, este protocolo fornece um método rápido e eficaz para criar os ratos em que as mutações genéticas alvejadas são introduzidas no sistema hematopoietic. Enquanto nosso laboratório está usando predominantemente este tipo de tecnologia para estudar o papel da hematopoiese clonal emprocessos de doença cardiovascular^{13,14,4,15, também}é aplicável a estudos de hematológicos malignidade¹⁶. Além disso, este protocolo pode ser estendido à análise de como as mutações do ADN em HSPC impactam a outra doença ou processos desenvolventes no sistema hematopoietic.

Para estabelecer um sistema robusto do vetor do Lentivirus, os estoques virais do Titer elevado e as condições aperfeiçoadas para a transdução e a transplantação de pilhas hematopoietic são exigidos. No protocolo, são fornecidas instruções sobre a preparação de um estoque viral de alto título na seção 1, otimizando as condições de cultura de células-tronco hematopoiéticas murinas na seção 2, métodos para transplante de medula óssea na seção 3, e avaliando Engraftment na secção 4.