Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia
Summary
Descritto sono protocolli per l’editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.
Abstract
La manipolazione dei geni nelle cellule staminali ematopoietiche utilizzando approcci convenzionali di transgenesi può essere dispendiosa in termini di tempo, costi e impegnativi. Approfittando dei progressi nella tecnologia di editing del genoma e nei sistemi di erogazione transgenici mediati da lentivirus, è descritto un metodo efficiente ed economico che stabilisce topi in cui i geni vengono manipolati specificamente nelle cellule staminali ematopoietiche. I lentivirus vengono utilizzati per trasdurre le cellule del midollo osseo con un’RNA guida (gRNA) mirato a geni specifici e a un gene di segnalazione della fluorescenza rossa (RFP), quindi queste cellule vengono trapiantate in topi C57BL/6 irradiati letale. I topi trapiantati con lentivirus che esprimono gRNA non mirati vengono utilizzati come controlli. L’innesto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte viene valutato mediante analisi citometrica del flusso di leucociti RFP positivi al sangue periferico. Utilizzando questo metodo, è possibile ottenere la trasduzione di cellule mieloidi e il 70% delle cellule linfoidi a 4 settimane dopo il trapianto. Il DNA genomico è isolato dalle cellule del sangue RFP-positive e parti del DNA del sito mirato sono amplificate dalla PCR per convalidare l’editing del genoma. Questo protocollo fornisce una valutazione ad alto throughput dei geni regolatori dell’ematopoiesi e può essere esteso a una varietà di modelli di malattia dei topi con coinvolgimento delle cellule ematopoietiche.
Introduction
Molti studi in ematologia e immunologia si basano sulla disponibilità di topi geneticamente modificati, tra cui topi transgenici/knock-out convenzionali e condizionali che utilizzano driver Cre specifici del sistema ematopoietico come Mx1-Cre, Vav-Cre e altri 1,2,3,4,5. Queste strategie richiedono la creazione di nuovi ceppi di topi, che possono richiedere molto tempo e gravare finanziariamente. Mentre i progressi rivoluzionari nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso la generazione di nuovi ceppi di topi in appena 3-4 mesi con l’adeguata competenza tecnica6,7,8,9 , è necessario molto più tempo per amplificare la colonia di topi prima di condurre esperimenti. Inoltre, queste procedure sono costose. Ad esempio, Jackson Laboratory elenca il prezzo attuale dei servizi di generazione di topi knock-out a 16.845 dollari per ceppo (a partire da dicembre 2018). Pertanto, i metodi più economici ed efficienti rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali sono più vantaggiosi.
La tecnologia CRISPR/Cas9, regolarmente interspaziata, ripete a breve ad occhiindromici/proteina CRISPR associata a ROF (CRISPR/Cas9) ha portato allo sviluppo di nuovi strumenti per un rapido ed efficiente editing del genoma basato su RNA e sequenza. Originariamente scoperto come meccanismo immunitario adattativo batterico per distruggere il DNA patogeno invasore, il sistema CRISPR/Cas9 è stato utilizzato come strumento per aumentare l’efficacia dell’editing del genoma nelle cellule eucariotiche e nei modelli animali. Sono stati adottati diversi approcci per trasmettere macchinari CRISPR/Cas9 in cellule staminali ematopoietiche (ad esempio, elettroporazione, nucleofezione, lipofezione, esodo virale e altri).
Qui, un sistema di lentivirus viene impiegato per traducire le cellule grazie alla sua capacità di infettare efficacemente le cellule staminali murine ematopoietiche di Cas9 e di confezionare insieme il costrutto guida per l’espressione dell’RNA, i promotori, le sequenze regolatorie e i geni che codificano proteine reporter fluorescenti (ad esempio, GFP, RFP). Utilizzando questo metodo, è stata ottenuta l’editing genico ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche del topo, seguita da una ricostituzione di successo del midollo osseo in topi letali irradiati10. Il vettore lentivirus impiegato per questo studio esprime i geni dei reporter Cas9 e GFP del comune promotore di EF1a con un sito di ingresso ribosomico interno a monte del gene del reporter. La sequenza di RNA guida è espressa da un promotore U6 separato. Questo sistema viene quindi utilizzato per creare mutazioni di inserimento e delezione nei geni del driver di ematopoiesi clonale candidati Tet2 e Dnmt3a10. Tuttavia, l’efficienza della trasduzione con questo metodo è relativamente bassa (-5%-10%) a causa delle grandi dimensioni dell’inserto vettoriale (13 Kbp) che limita l’efficienza della trasduzione e riduce il titro del virus durante la produzione.
In altri studi, è stato dimostrato che la dimensione più grande dell’RNA virale influisce negativamente sia sulla produzione di virus che sull’efficienza della trasduzione. Ad esempio, un aumento di 1 kb nella dimensione dell’inserto è segnalato per ridurre la produzione di virus del 50%, e l’efficienza della trasduzione diminuirà a più del 50% nelle cellule staminali ematopoietiche del topo11. Pertanto, è vantaggioso ridurre il più possibile le dimensioni dell’inserto virale per migliorare l’efficienza del sistema.
Questa lacuna può essere superata impiegando topi transgenici Cas9, in cui la proteina Cas9 è espressa in modo flessibile o inducibile12. I topi knock-in CRISPR/Cas9 di tipo constitutivo escludano Cas9 endonuclease ed EGFP dal promotore CAG presso il locus Rosa26 in modo onnipresente. Così, un costrutto con sgRNA sotto il controllo del promotore U6 e del gene reporter RFP sotto il controllo del promotore core EF1a può essere consegnato utilizzando il vettore lentivirus per ottenere l’editing del genoma. Con questo sistema, i geni delle cellule staminali ematopoietiche sono stati modificati con successo, mostrando un’efficienza di trasduzione del 90%. Pertanto, questo protocollo fornisce un metodo rapido ed efficace per creare topi in cui nel sistema ematopoietico mirate vengono introdotte mutazioni genetiche mirate. Mentre il nostro laboratorio utilizza prevalentemente questo tipo di tecnologia per studiare il ruolo dell’ematopoiesi clonale nei processi di malattia cardiovascolare13,14,15, è applicabile anche agli studi di ematologica malignità16. Inoltre, questo protocollo può essere esteso all’analisi di come le mutazioni del DNA nell’HSPC influiscono su altri processi di malattia o di sviluppo nel sistema ematopoietico.
Per stabilire un robusto sistema vettoriale di lentivirus, sono necessari elevati titoli virali di titro e condizioni ottimizzate per la trasduzione e il trapianto di cellule ematopoietiche. Nel protocollo vengono fornite istruzioni sulla preparazione di uno stock virale ad alto titolo titer nella sezione 1, ottimizzando le condizioni di coltura delle cellule staminali ematopoietiche murine nel paragrafo 2, i metodi per il trapianto di midollo osseo nella sezione 3 e la valutazione l’innesto nella sezione 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il vantaggio di questo protocollo è la creazione di modelli animali che ospitano mutazioni specifiche nelle cellule ematopoietiche in modo rapido e altamente economico rispetto agli approcci transgenici murini convenzionali. Si è scoperto che questa metodologia consente la generazione di topi con manipolazioni geniche delle cellule ematopoietiche entro 1 mese. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che richiedono ulteriore considerazione.
Screening della sequenza di gR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dell’American Heart Association 17POST33670076. K. W. era supportato dalle sovvenzioni NIH R01 HL138014, R01 HL141256 e R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
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