Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen
Summary
Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.
Abstract
Die Manipulation von Genen in hämatopoetischen Stammzellen mit konventionellen Transgeneseansätzen kann zeitaufwändig, teuer und herausfordernd sein. Durch fortschritte In der Genom-Editing-Technologie und lentivirusvermittelten Transgen-Bereitstellungssystemen wird hier eine effiziente und wirtschaftliche Methode beschrieben, die Mäuse etabliert, bei denen Gene speziell in hämatopoetischen Stammzellen manipuliert werden. Lentiviren werden verwendet, um Cas9-extierende Linien-negative Knochenmarkzellen mit einer Guide-RNA (gRNA) zu transduzieren, die auf bestimmte Gene und ein rotes Fluoreszenz-Reporter-Gen (RFP) abzielt, dann werden diese Zellen in tödlich bestrahlte C57BL/6-Mäuse transplantiert. Mäuse, die mit Lentivirus transplantiert werden, die nicht zielgerichtete gRNA exdrücken, werden als Kontrollen verwendet. Die Transplantation von transduzierten hämatopoetischen Stammzellen wird durch zytometrische Durchflussanalyse von RFP-positiven Leukozyten peripheren Blutes bewertet. Mit dieser Methode können 90 % Transduktion von myeloischen Zellen und 70 % der Lymphzellen nach 4 Wochen nach der Transplantation erreicht werden. Genomische DNA wird aus RFP-positiven Blutzellen isoliert, und Teile der Ziel-Site-DNA werden durch PCR verstärkt, um die Genombearbeitung zu validieren. Dieses Protokoll bietet eine hochdurchsatzhohe Auswertung von hämatopoese-regulatorischen Genen und kann auf eine Vielzahl von Mauskrankheitsmodellen mit hämatopoetischer Zellbeteiligung erweitert werden.
Introduction
Viele Studien in Hämatologie und Immunologie basieren auf der Verfügbarkeit von genetisch veränderten Mäusen, einschließlich konventioneller und bedingter transgener/knock-out-Mäuse, die hämatopoetische systemspezifische Cre-Treiber wie Mx1-Cre, Vav-Cre und andere verwenden. 1,2,3,4,5. Diese Strategien erfordern die Etablierung neuer Mausstämme, die zeitaufwändig und finanziell belastend sein können. Während revolutionäre Fortschritte in der Genom-Editing-Technologie die Erzeugung neuer Mausstämme in nur 3-4 Monaten mit dem entsprechenden technischen Know-how ermöglicht haben6,7,8,9 , viel mehr Zeit ist erforderlich, um die Mauskolonie zu verstärken, bevor Experimente durchgeführt werden. Darüber hinaus sind diese Verfahren kostspielig. Beispielsweise listet Jackson Laboratory den aktuellen Preis für Dieerzeugungsdienste für Knock-out-Mäuse auf 16.845 US-Dollar pro Stamm (Stand Dezember 2018) auf. Daher sind Methoden, die wirtschaftlicher und effizienter sind als herkömmliche murintransgene Ansätze, vorteilhafter.
Die clusterierte, regelmäßig interspacete kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierte Protein-9-Technologie (CRISPR/Cas9) hat zur Entwicklung neuer Werkzeuge für eine schnelle und effiziente RNA-basierte, sequenzspezifische Genombearbeitung geführt. Ursprünglich als bakterieller adaptiver Immunmechanismus zur Zerstörung der eindringenden Pathogen-DNA entdeckt, wurde das CRISPR/Cas9-System als Werkzeug zur Steigerung der Wirksamkeit der Genombearbeitung in eukaryotischen Zellen und Tiermodellen eingesetzt. Eine Reihe von Ansätzen wurden verwendet, um CRISPR/Cas9-Maschinen in hämatopoetische Stammzellen zu übertragen (d. h. Elektroporation, Nukleofektion, Lipofektion, virale Abgabe und andere).
Hier wird ein Lentivirus-System eingesetzt, um Zellen zu transduzieren, da es in der Lage ist, Cas9-exezierende murine hämatopoetische Stammzellen effektiv zu infizieren und das Führungs-RNA-Expressionskonstrukt, Promotoren, regulatorische Sequenzen und Gene, die kodieren, zusammenzupacken. fluoreszierende Reporterproteine (z. B. GFP, RFP). Mit dieser Methode wurde eine Ex-vivo-Genbearbeitung von hämatopoetischen Stammzellen der Maus erreicht, gefolgt von einer erfolgreichen Rekonstitution des Knochenmarks bei tödlich bestrahlten Mäusen10. Der für diese Studie verwendete Lentivirus-Vektor drückt die Cas9- und GFP-Reportergene aus dem gemeinsamen Kern-EF1a-Promotor mit einer internen ribosomalen Einstiegsstelle vor dem Reportergen aus. Die Rna-Führungssequenz wird von einem separaten U6-Promotor exprimiert. Dieses System wird dann verwendet, um Insertions- und Deletionsmutationen in den Kandidaten-Klonhämatopoese-Treibergen Tet2 und Dnmt3a10zu erzeugen. Die Transduktionseffizienz bei dieser Methode ist jedoch relativ gering (ca. 5%-10%) aufgrund der großen Größe des Vektoreinsatzes (13 Kbp), die die Transduktionseffizienz und die Virentiter während der Produktion reduziert.
In anderen Studien wurde gezeigt, dass eine größere virale RNA-Größe sowohl die Virusproduktion als auch die Transduktionseffizienz negativ beeinflusst. Beispielsweise wird eine Erhöhung der Insert-Größe um 1 kb gemeldet, um die Virusproduktion um 50 % zu verringern, und die Transduktionseffizienz wird bei hämatopoetischen Stammzellen der Maus auf mehr als 50 % sinken11. Daher ist es vorteilhaft, die Größe des viralen Einsatzes so weit wie möglich zu reduzieren, um die Effizienz des Systems zu verbessern.
Dieses Manko kann durch den Einsatz von Transgenmäusen von Cas9 überwunden werden, bei denen das Cas9-Protein entweder konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird12. Die konstitutiven CRISPR/Cas9-Knock-in-Mäuse drücken Cas9 Endonuklease und EGFP aus dem CAG-Promotor am Rosa26-Ort auf allgegenwärtige Weise aus. So kann ein Konstrukt mit sgRNA unter der Kontrolle des U6-Promoters und des RFP-Reportergens unter der Kontrolle des EF1a-Kernpromotors mit dem Lentivirus-Vektor geliefert werden, um eine Genombearbeitung zu erreichen. Mit diesem System wurden die Gene hämatopoetischer Stammzellen erfolgreich bearbeitet, was eine Transduktionseffizienz von 90 % zeigt. Somit bietet dieses Protokoll eine schnelle und effektive Methode, um Mäuse zu erstellen, bei denen gezielte Genmutationen in das hämatopoetische System eingeführt werden. Während unser Labor diese Art von Technologie hauptsächlich verwendet, um die Rolle der klonalen Hämatopoese in Herz-Kreislauf-Erkrankungen13,14,15zu untersuchen, ist es auch auf Studien hämatologischer bösartig16. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf die Analyse erweitert werden, wie DNA-Mutationen in HSPC andere Krankheits- oder Entwicklungsprozesse im hämatopoetischen System beeinflussen.
Um ein robustes Lentivirus-Vektorsystem zu etablieren, sind hohe Tikern-Virenbestände und optimierte Bedingungen für die Transduktion und Transplantation hämatopoetischer Zellen erforderlich. Im Protokoll werden Anweisungen zur Herstellung eines Hochtiter-Virusbestands in Abschnitt 1, zur Optimierung der Kulturbedingungen von murinen hämatopoetischen Stammzellen in Abschnitt 2, Methoden zur Knochenmarktransplantation in Abschnitt 3 und zur Bewertung der Engraftment in Abschnitt 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Vorteil dieses Protokolls ist die Schaffung von Tiermodellen, die spezifische Mutationen in hämatopoetischen Zellen in einer schnellen und äußerst kostengünstigen Weise im Vergleich zu herkömmlichen transgenen Ansätzen der Maus beherbergen. Es wurde festgestellt, dass diese Methode die Erzeugung von Mäusen mit hämatopoetischen Zellgenmanipulationen innerhalb eines Monats ermöglicht. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, die einer weiteren Prüfung bedürfen.
<stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. S. wurde von einem Postdoktorandenstipendium der American Heart Association 17POST33670076 unterstützt. K. W. wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 HL138014, R01 HL141256 und R01 HL139819 unterstützt.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
