Lentivirale CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking voor de studie van hematopoietische cellen in ziekte modellen

Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen ^1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nieuwe muis stammen in slechts 3-4 maanden mogelijk hebben gemaakt met de juiste technische expertise^6,7,8,9 , veel meer tijd is nodig om de muis kolonie te versterken voordat experimenten worden nagestreefd. Bovendien zijn deze procedures kostbaar. Bijvoorbeeld, Jackson laboratorium vermeldt de huidige prijs van knock-out mice generatie diensten op $16.845 per stam (vanaf december 2018). Daarom zijn methodes die zuiniger en efficiënter zijn dan conventionele Murine transgene benaderingen voordeliger.

Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe tools voor snelle en efficiënte RNA-gebaseerde, sequentie-specifieke genoom bewerking. Oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële adaptieve immuun mechanisme om het binnenvallende pathogeen DNA te vernietigen, is het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt als een instrument om de effectiviteit van genoom bewerking in eukaryote cellen en diermodellen te verhogen. Er zijn een aantal benaderingen toegepast om CRISPR/Cas9-machines te verzenden naar hematopoietische stamcellen (d.w.z. elektroporatie, nucleofectie, lipofectie, virale levering en andere).

Hier wordt een lentivirussysteem gebruikt om cellen te leiden als gevolg van zijn vermogen om de Cas9-uitzinnige muriene hematopoietische stamcellen effectief te infecteren en samen de RNA-expressie constructie, promoters, regelgevings sequenties en genen die coderen fluorescerende reporter eiwitten (d.w.z. GFP, RFP). Met behulp van deze methode is ex vivo genbewerking van hematopoietische stamcellen van de muis bereikt, gevolgd door een succesvolle reconstitutie van het beenmerg in dodelijk bestraalde muizen¹⁰. De lentivirus vector die voor deze studie wordt gebruikt, toont de Cas9 en GFP reporter genen van de common core EF1a Promoter met een interne ribosomale intrede site stroomopwaarts van het reporter gen. De gids RNA-sequentie wordt uitgedrukt uit een afzonderlijke U6-promotor. Dit systeem wordt vervolgens gebruikt voor het maken van inbrengen en verwijderen mutaties in de kandidaat klonale Hematopoiesis bestuurder genen Tet2 en Dnmt3a¹⁰. Echter, de transductie-efficiëntie door deze methode is relatief laag (~ 5%-10%) door het grote formaat van de vector insert (13 KBP) die de transductie-efficiëntie beperkt en de virus titer vermindert tijdens de productie.

In andere studies, het is aangetoond dat grotere virale RNA grootte negatief beïnvloedt zowel de virus productie en transductie efficiëntie. Bijvoorbeeld, een toename van 1 KB in wisselplaatgrootte wordt gerapporteerd aan de virus productie te verlagen door ~ 50%, en transductie-efficiëntie zal afnemen tot meer dan 50% in de muis hematopoietische stamcellen¹¹. Het is dus voordelig om de grootte van de virale insert zoveel mogelijk te verminderen om de efficiëntie van het systeem te verbeteren.

Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het gebruik van Cas9 transgene muizen, waarbij het Cas9-eiwit wordt uitgedrukt in een constitutieve of niet-industriële manier¹². De constitutieve CRISPR/Cas9 knock-in muizen drukt Cas9 endonuclease en EGFP uit van de CAG-promotor op de Rosa26 locus op een alomtegenwoordige manier. Zo kan een constructie met sgRNA onder controle van de promotor en RFP reporter gene onder de controle van de core EF1a promotor worden geleverd met behulp van de lentivirus vector om genoom bewerking te bereiken. Met dit systeem, de genen van hematopoietische stamcellen zijn met succes bewerkt, tonen een ~ 90% transductie efficiëntie. Dit protocol biedt dus een snelle en effectieve methode om muizen te creëren waarin gerichte genmutaties in het hematopoietische systeem worden geïntroduceerd. Terwijl ons lab is voornamelijk met behulp van dit soort technologie te bestuderen van de rol van van klonen Hematopoiesis bij cardiovasculaire ziekteprocessen^13,14,15, het is ook van toepassing op studies van hematologische maligniteiten¹⁶. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot de analyse van de invloed van DNA-mutaties in HSPC op andere ziekte-of ontwikkelingsprocessen in het hematopoietische systeem.

Om een robuust lentivirus vector systeem te vestigen, zijn hoge titer virale voorraden en geoptimaliseerde omstandigheden voor de transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist. In het protocol worden instructies gegeven over de bereiding van een hoog titer-virale bestanddeel in rubriek 1, waarbij de cultuuromstandigheden van de erytrocyten hematopoietische stamcellen in rubriek 2, de methoden voor beenmergtransplantatie in rubriek 3, worden geëvalueerd en engraftment in rubriek 4.