لينتيفيرال CRISPR/كاس 9-بوساطة الجينوم التحرير لدراسة خلايا الدم في نماذج الامراض
Summary
ويرد وصفها بروتوكولات لتحرير الجينوم عاليه الكفاءة من الجذعية التي تكون الدم murine والخلايا سلف (hspc) من قبل نظام crispr/كاس 9 لتطوير بسرعة أنظمه نموذج الماوس مع التعديلات الجينية الخاصة بالنظام التي تكون الدم.
Abstract
يمكن ان يكون التلاعب بالجينات في الخلايا الجذعية للدم باستخدام مقاربات التكوين التقليدية مضيعه للوقت ومكلفه وصعبه. الاستفادة من التقدم المحرز في تكنولوجيا تحرير الجينوم ونظم إيصال الجينات عبر اللينتيفيروس ، فان طريقه فعاله واقتصاديه توصف هنا بأنها تنشئ فئران يتم فيها التلاعب بالجينات علي وجه التحديد في الخلايا الجذعية للدم. وتستخدم لينتيفيروسيس لنقل كاس 9-التعبير عن خلايا نخاع العظم السالبة مع دليل RNA (gRNA) استهداف جينات محدده والجينات مراسل الأحمر الفلورية (المناقصة) ، ثم يتم زرع هذه الخلايا في قاتل المشع C57BL/6 الفئران. تستخدم الفئران المزروعة باللينتيفيروس التي تعبر عن عدم استهداف gRNA كعناصر تحكم. يتم تقييم الخلايا الجذعية التي يتم توصيلها بالدم من خلال تحليل تدفق الكريات البيضاء الايجابيه لعروض العروض الدموية للدم المحيطي. باستخدام هذه الطريقة ، ~ 90 ٪ محول الخلايا النخاعية و ~ 70 ٪ من الخلايا اللمفاوية في 4 أسابيع بعد زرع يمكن ان يتحقق. يتم عزل الحمض النووي الجيني من خلايا الدم الايجابيه لعروض العروض ، ويتم تضخيم أجزاء من الحمض النووي للموقع المستهدف من قبل PCR للتحقق من تحرير الجينوم. يوفر هذا البروتوكول تقييما عالي الانتاجيه للجينات التنظيمية للدم ويمكن توسيعه ليشمل مجموعه متنوعة من نماذج امراض الفئران مع مشاركه خلايا الدم.
Introduction
العديد من الدراسات في امراض الدم والمناعة تعتمد علي توافر الفئران المعدلة وراثيا, بما في ذلك التقليدية والشرطية الوراثية/ضرب الخروج الفئران التي تستخدم البرامج الغذائية الخاصة بنظام Cre السائقين مثل Mx1, Vav-Cre, وغيرها 1،2،3،4،5. وتتطلب هذه الاستراتيجيات إنشاء سلالات فاره جديده ، يمكن ان تستغرق وقتا طويلا وتثقل كاهل المالية. في حين ان التقدم الثوري في تكنولوجيا التحرير الجينوم مكنت توليد سلالات الماوس جديده في عدد قليل من 3-4 أشهر مع الخبرة التقنية المناسبة6,7,8,9 ، يلزم المزيد من الوقت لتضخيم مستعمره الماوس قبل متابعه التجارب. الاضافه إلى ذلك ، فان هذه الإجراءات مكلفه. فعلي سبيل المثال ، يسرد مختبر جاكسون السعر الحالي لخدمات جيل الفئران التي تبلغ $16,845 لكل سلاله (اعتبارا من كانون الأول/ديسمبر 2018). التالي ، فان الأساليب الأكثر اقتصادا وكفاءه من النهج الوراثية التقليدية لmurine هي أكثر فائده.
متفاوتة المسافات بانتظام متباعدة المتقاربة متكررة/CRISPR البروتين المرتبطة 9 (CRISPR/كاس 9) التكنولوجيا قد أدت إلى تطوير أدوات جديده لسرعه وكفاءه المستندة إلى RNA ، تسلسل الجينوم الخاصة التحرير. اكتشف أصلا كاليه مناعية بكتيرية متكيفة لتدمير الحمض النووي المسبب للمرض الغازي ، وقد استخدم نظام CRISPR/كاس 9 كاداه لزيادة فعاليه تحرير الجينوم في الخلايا النواة والنماذج الحيوانية. وقد استخدم عدد من النهج لنقل آلات CRISPR/كاس 9 إلى الخلايا الجذعية التي تكون الدم (اي ، الكهربية ، النيوفيكشن ، ليبوكشن ، والولادة الفيروسية ، وغيرها).
هنا ، يتم استخدام نظام لينتيفيروس لتحويل الخلايا بسبب قدرتها علي الاصابه بشكل فعال كاس 9-التعبير عن الخلايا الجذعية التي تكون الدم murine وحزمه معا دليل الحمض الريبي النيبالي بناء ، والمروجين ، وتسلسل التنظيمية ، والجينات التي ترميز البروتينات الفلورية مراسل (اي ، GFP ، وعروض العروض). باستخدام هذه الطريقة ، وقد تم السابقة الجسم الفيفو التحرير من الخلايا الجذعية الماوس الدم التي تم تحقيقها ، تليها أعاده ناجحه من نخاع العظم في الفئران قاتل المشع10. ويعبر الناقل اللينتيفيروس المستخدم لهذه الدراسة عن جينات مراسل كاس 9 و GFP من المروج EF1a الأساسي المشترك مع موقع دخول ريبوسومال داخلي من الجينات المراسلة. يتم التعبير عن تسلسل الدليل RNA من مروج U6 منفصل. ويستخدم هذا النظام بعد ذلك لخلق طفرات الادراج والحذف في المرشح التي تكون الدم المورثات سائق الجينات Tet2 و Dnmt3a10. ومع ذلك ، فان كفاءه المحولات بهذه الطريقة منخفضه نسبيا (~ 5 ٪-10 ٪) بسبب الحجم الكبير للمتجه ادراج (13 Kbp) الذي يحد من كفاءه المحول ويقلل من الفيروسات اثناء الإنتاج.
وفي دراسات أخرى ، تبين ان حجم الحمض الريبي الفيروسي الأكبر يؤثر سلبا علي كل من إنتاج الفيروس وكفاءه المحول. علي سبيل المثال ، يتم الإبلاغ عن زيادة 1 كيلوبايت في حجم الادراج لإنقاص إنتاج الفيروسات بنسبه ~ 50% ، ستنخفض كفاءه التوصيل إلى أكثر من 50% في الخلايا الجذعية للدم التي تكون الخلية11. التالي ، فانه من المفيد للحد من حجم ادراج الفيروسية قدر الإمكان لتحسين كفاءه النظام.
ويمكن التغلب علي هذا القصور عن طريق استخدام كاس 9 الفئران المحورة وراثيا ، والتي يتم التعبير عن بروتين كاس 9 في اما بطريقه تاسيسيه أو محرض12. التاسيسيه CRISPR/كاس 9 تدق في الفئران يعبر عن كاس 9 كريات الوحيدة النوى و EGFP من المروج CAG في Rosa26 موضع في كل مكان. التالي ، يمكن تسليم بناء مع sgRNA تحت سيطرة U6 المروج والجينات مراسل تقديم العروض تحت سيطرة المروج EF1a الاساسيه باستخدام ناقل اللينتيفيروس لتحقيق تحرير الجينوم. مع هذا النظام ، تم تحرير جينات الخلايا الجذعية التي تكون الدم بنجاح ، والتي تبين كفاءه المحولة ~ 90 ٪. التالي ، فان هذا البروتوكول يوفر طريقه سريعة وفعاله لإنشاء الفئران التي يتم إدخال طفرات الجينات المستهدفة في نظام التي تكون الدم. في حين ان لدينا مختبر يستخدم في الغالب هذا النوع من التكنولوجيا لدراسة دور تكون الدم النسيلي في عمليات امراض القلب والاوعيه الدموية13,14,15, وهو ينطبق أيضا علي دراسات الدموية الأورام الخبيثة16. وعلاوة علي ذلك ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل تحليل كيفيه تاثير طفرات الحمض النووي في HSPC علي الامراض الأخرى أو العمليات التنموية في النظام الغذائي.
لإنشاء نظام ناقلات لينتيفيروس قويه, المخزونات الفيروسية عيار عاليه والظروف الأمثل لنقل وزرع الخلايا التي تكون الدم مطلوبه. وفي البروتوكول ، تقدم التعليمات بشان اعداد المخزون الفيروسي العالي الارتفاع في القسم 1 ، بما يحسن الظروف الثقافية للخلايا الجذعية التي تشكل الدم في المادة 2 ، وأساليب زرع نخاع العظم في القسم 3 ، وتقييم في القسم 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتمثل ميزه هذا البروتوكول في إنشاء نماذج حيوانيه تاوي طفرات محدده في الخلايا التي تكون فيها الدم بطريقه سريعة وفعاله من حيث التكلفة مقارنه بالنهج المعدلة وراثيا للماوس التقليدي. وقد وجد ان هذه المنهجية تمكن جيل من الفئران مع التلاعب الجينات الخلية التي تكون الدم في غضون 1 شهر. وهناك عده خ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
[س. س.] كان ساندت بامريكيه قلب جمعيه دكتوراه زمالة [17 بوس33670076]. تم دعم k. w. من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 HL138014 ، R01 HL141256 ، و R01 HL139819.
Materials
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216– | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
