استخدام مجموعة مستضد الأنفلونزا الدقيقة لقياس اتساع الأجسام المضادة للمصل عبر الأنواع الفرعية للفيروس
Summary
نقدم بروتوكولًا لاستخدام مجموعة بروتين دقيقة تم إنشاؤها بواسطة طباعة مستضدات الأنفلونزا على الشرائح المغلفة بالنيتروسيلولوز لسبر المصل في نفس الوقت لعدة أنواع من الأجسام المضادة ضد أكثر من 250 مستضدًا من سلالات الفيروسات المختلفة، وبالتالي السماح بقياس اتساع الأجسام المضادة المصل عبر الأنواع الفرعية للفيروس.
Abstract
ولا يزال فيروس الأنفلونزا سبباً هاماً للوفيات في جميع أنحاء العالم بسبب الفعالية المحدودة لللقاحات المتاحة حالياً. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية التي يواجهها تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية في التنوع الشديد في المضادات الصناعية الناجم عن الانجراف المضاد للجينات. ويتطلب التغلب على هذا التحدي أدوات بحثية جديدة لقياس اتساع الأجسام المضادة للمصل الموجهة ضد العديد من سلالات الفيروسات عبر أنواع فرعية مختلفة مضادة للجينات. نقدم هنا بروتوكولًا لتحليل اتساع الأجسام المضادة للمصل ضد سلالات فيروس الأنفلونزا المتنوعة باستخدام مجموعة بروتين دقيقة من مستضدات الأنفلونزا.
يتم بناء هذه الصفيف مستضد الأنفلونزا عن طريق طباعة الهيماغلوتينين النقي والمستضدات neuraminidase على غشاء المغلفة النيتروسيلولوزيباستخدام طابعة microarray. يتم احتضان السيرا البشرية على المصفوفة الدقيقة لربط الأجسام المضادة ضد مستضدات الأنفلونزا. يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية الكم نقطة مترافق للكشف في وقت واحد IgG وIgA الأجسام المضادة ملزمة لكل مستضد على المصفوفة الدقيقة. يتم قياس الربط الكمية للجسم المضاد كشدة الفلورة باستخدام صورة محمولة. وتظهر النتائج التمثيلية لتبين قابلية التحلل في قياس الأجسام المضادة للأنفلونزا ذات النوع الفرعي وعبر التفاعلية في السيرا البشرية.
بالمقارنة مع الأساليب التقليدية مثل ELISA، توفر الصفيف الدقيق مستضد الأنفلونزا نهج ًا متعدد الإنتاجية عالي الإنتاجية قادرًا على اختبار مئات السيرا لأنواع متساويات الأجسام المضادة المتعددة ضد مئات المستضدات في إطار زمني قصير، وبالتالي فقد التطبيقات في المراقبة المصلية وتطوير اللقاحات. ويتمثل القيد في عدم القدرة على التمييز بين الأجسام المضادة الملزمة وتحييد الأجسام المضادة.
Introduction
فيروس الأنفلونزا هو المسؤول عن فقدان 20 مليون سنة حياة سنويا ً بسبب الوفاة أو الإعاقة، بما في ذلك 1% من جميع الوفيات في جميع أنحاء العالم كل عام، مع آثار غير متناسبة على المسنين والسكان في المناطق المدارية والعالم النامي1، 2،3. وبالإضافة إلى عبء الأمراض الناجمة عن الأوبئة الموسمية، فإن ظهور سلالات جديدة من الأنفلونزا عن طريق إعادة التشكيل الجيني إما بشكل طبيعي في المضيفين المشتركين أو بشكل مصطنع للإرهاب البيولوجي يمكن أن يؤدي إلى أوبئة في جميع أنحاء العالم مع انتشار سريع وفتكا ً عالياً 4 , 5. فيحين أن العديد من لقاحات الأنفلونزا متوفرة حالياً، فإن فعاليتها محدودة بخصوصية النوع الفرعي6،مما يخلق الحاجة إلى تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية التي تمنح مناعة طويلة الأمد ضد فيروس متعدد سلالات7.
ويتمثل أحد التحديات الرئيسية التي يواجهها تطوير لقاحات الأنفلونزا العالمية في التنوع الشديد في المضادات بين السلالات. إن خصوصية اللقاحات الحالية المضادة للجينات إلى جانب التباين المضاد للجينات في الفيروسات المتداولة تخلق عدم تطابق بين سلالات اللقاحات وسلالات الدوران. وهذا يمنح ميزة تطورية تفضل المزيد من الانجراف الوراثي بعيدا عن سلالات اللقاح خلال الوباء، والحد من فعالية اللقاح في كثير من الأحيان إلى أقل من 50٪8،9. مصدر إضافي لعدم التطابق المضاد للجينات هو الطفرات الفيروسية التكيفية للبيض التي يتم توليدها أثناء تصنيع اللقاح، والتي تؤدي إلى الأجسام المضادة التي تربط بشكل سيء بالفيروسات المتداولة10و11 .
وسيتطلب التغلب على هذا التحدي المتمثل في التنوع العالي في مجال المضادات الجينات أدوات بحثية جديدة لتوصيف اتساع الاستجابات المناعية الموجودة من قبل والناجمة عنها عبر المتغيرات المضادة للجينات ذات الصلة سريرياً في عينات المصل والغشاء المخاطي. تقتصر الأساليب المتاحة حاليًا، بما في ذلك تثبيط الهيماغلوتين (HAI)، والتحييد الجزئي (MN)، وELISA التقليدي، على الكشف عن الأجسام المضادة ضد سلالة فيروس واحدة في كل مرة، وبالتالي فإن استخدامها للكشف عن أنواع متساوي الأجسام المضادة المتعددة ضد سلالات فيروس متعددة بسرعة يستنفد عينة السريرية المتاحة والموارد المختبرية. وعلاوة على ذلك، تتطلب هذه الوحدة والحركة ثقافة فيروس حية لا تتوفر إلا في مختبرات متخصصة.
microarrays البروتين، التي يحتمل أن تتكون من ما يصل إلى الآلاف من المستضدات المطبوعة على الشرائح المغلفة النيتروسيلولوز كما هو مبين في الشكل1، يمكن ملء هذه الحاجة12. ويمكن إنتاج هذه المصفوفات الدقيقة وبحثت بطريقة عالية الإنتاجية مع استهلاك كميات صغيرة من العينات السريرية لتحديد مستويات isotype/subtype الجسم المضادة الكمية ضد كل مستضد الفردية على مجموعة. وقد تم تطبيق هذا النهج لاكتشاف مستضد لتطوير التشخيص واللقاحات ضد مسببات الأمراض المعدية متعددة13. وحتى الآن، أنتجنا مُرائف البروتين الدقيقة لأكثر من 35 ممرضة بما في ذلك أكثر من 60,000 من مجموع البروتينات المعبر عنها واستخدمناها للتحقيق في أكثر من 30,000 سيرا بشرية من الأفراد المصابين والسيطرة. وقد جعلت منصة التصوير المحمولة التي تم تطويرها مؤخرًا لشرائح المصفوفة الدقيقة هذه المنهجية أكثر سهولة للمستخدم النهائي14.
بناء على أعمال واسعة النطاق السابقة من قبل العديد من المساهمين في مجال15،16،17،18،19، تم مؤخرا تطوير ميكروراي بروتين الأنفلونزا التي تحتوي على أكثر من 250 الهيماغلوتينين النقي (HA) المتغيرات المضادة للجينات مع تمثيل جميع الأنواع الفرعية 1812،20. وباستخدام هذه المنهجية، ثبت أن عدوى الأنفلونزا الطبيعية تولد أجساماً مضادة من نوع IgG وIgA ذات تفاعل واسع النطاق ضد الأنواع الفرعية المرتبطة بعلم الوراثة من نوع HA، في حين أن التطعيم ضد الأنفلونزا العضلية لم يولد سوى نوع فرعي محدد من نوع IgG. الأجسام المضادة21. ومع ذلك، فقد تبين أن إضافة عاقد ينشط مستقبلات شبيهة بالرسوم للقاحات الأنفلونزا لتوسيع استجابة الأجسام المضادة IgG التي تم الحصول عليها عبر الأنواع الفرعية HA في الدراسات الحيوانية22.
وتستخدم هذه المجموعة الدقيقة حاليا ً للتحقيق في السيرا التي تم جمعها من دراسة أترابية مستقبلية لطلاب الجامعات الذين تم متابعتهم بسبب عدوى الأنفلونزا. هنا، يتم الإبلاغ عن منهجية الصفيف مستضد الأنفلونزا مع إظهار إمكانية استنساخ الأنواع الفرعية وعبر رد الفعل في مجموعة فرعية من العينات من هذه الدراسة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الصفيف من الأنفلونزا الموضح هنا قابل للتكيف مع أي مشروع يتطلب تحليل استجابات الأجسام المضادة للعديد من المستضدات. يمكن استخدام منصة microarray مع أي مجموعة مرغوب ة من مستضدات البروتين التي يتم التعبير عنها في أي نظام يمكن أن يحقق 0.1 ملغ /مل أو عائد أعلى مع أو بدون تنقية كما سبق وصفه12. إذا كانت مستضدات البروتين غير المنقي (على سبيل المثال، معبراً عنها في النسخ في المختبر ونظام الترجمة) تستخدم مباشرة لطباعة المصفوفات الدقيقة، ينبغي إضافة مكونات نظام تعبير البروتين (على سبيل المثال، E. coli lysate) إلى حاجز حظر يستخدم للتخزين المؤقت المستخدم في تخفيف سيرا والأجسام المضادة لمراقبة الجودة من أجل منع أي الأجسام المضادة الموجهة ضد هذه المكونات. تتوفر تكوينات الشرائح مع عدد أقل من منصات أكبر على كل شريحة لاستيعاب عدد أكبر من المستضدات لكل صفيف. لهذه الدراسة، استخدمنا GeneMachines OmniGrid 100 طابعة microarray التي تستخدم دبابيس التي تتصل مباشرة سطح النيتروسيلولوسي لإيداع البقع على مجموعة. في حين أن هذه الطابعة microarray لم تعد متوفرة تجارياً، يمكن استخدام طابعات الصفيف الصغير الأخرى المتوفرة تجارياً في هذا البروتوكول ولكن قد تتطلب دبابيس مخصصة (إما جهة اتصال أو غير اتصال) وبرامج ويجب أن يكون لها دقة موضعية كافية والتوافق مع الشرائح والصور. اعتمادا على تفاعل سيرا، يمكن استخدام التخفيفات من 1:50 إلى 1:400. يمكن استخدام المخزن المؤقت الخالي من المصل كتحكم سلبي، في حين يمكن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المعروفة بربطها بالمستضد كتحكم إيجابي.
يجب أن يكون المستخدمون على علم ببعض مشكلات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. الغرض من التحقق من جودة مراقبة باستخدام الأجسام المضادة لعلامته هو التحقق من وجود أي مستضدات التي لم تكن الطباعة ناجحة. أي البقع التي تعطي باستمرار إشارة منخفضة في التحقق من جودة صفائف متعددة من المرجح أن تمثل مستضد غير كافية المطبوعة. وتشمل الأسباب المحتملة التجميع أو هطول الأمطار أو مستضد في لوحة المصدر أو ضعف الاتصال بين دبوس الطباعة وشريحة microarray بسبب سمك متغير من لوحة nitrocellulose. في هذه المرحلة، نحن لا نقوم بتطبيع الفحص على أساس النتائج الكمية لفحص الجودة، نظراً لأن الربط المكتشف للأجسام المضادة له يمكن أن يتأثر بتوافر هذه العلامة، التي تعتمد على التوافق ثلاثي الأبعاد محددة لكل مستضد.
توفر المصفوفة الدقيقة لمستضد الأنفلونزا العديد من المزايا على الطرق التقليدية مثل ELISA وهي مكملة للتجارب الوظيفية مثل HAI وMN. ال [16-بوّد] بروتين [ميكرور] [ا] عينة [بروفير] تكنولوجيا مع قدرة أن يقيس أجسام مضادّة من يتعدّد [إيستيب] في وقت واحد ضدّ تقريبا 300 مستضدات من 1 [فل] من مصل. يمكن زيادة عدد المستضدات إلى الآلاف عن طريق تقليل عدد الوسادات لكل شريحة. كما أن الفحص المتعدد يوفر وقت الموظفين والموارد الاستهلاكية، نظراً إلى أنه يمكن فحص مئات السيرا بحثاً عن الأجسام المضادة في يومين، وجميع المواد الأخرى غير الشرائح والكواشف قابلة للاغتسال حتى لا تولد كميات كبيرة من النفايات البلاستيكية.
في حين أن الطابعات microarray قد لا يتم توزيعها على نطاق واسع، يمكن طباعة شرائح المصفوفة الدقيقة في موقع مركزي ومن ثم نقلها إلى المستخدم النهائي للتحقق. والمعدات الوحيدة اللازمة للتحقق هي الصور المنخفضة التكلفة والمحمولة. والهدف من نشر هذا البروتوكول هو زيادة انتشار استخدام هذه التقنية.
وتتمثل القيود الرئيسية للمصفوفة الدقيقة لمضد الأنفلونزا في عدم القدرة على توصيف وظيفة وحركية الأجسام المضادة المكتشفة. تقوم المصفوفة الدقيقة بالكشف عن مجموعة متعددة الكلونات من الأجسام المضادة الملزمة لكل مستضد. قد تكون هذه الأجسام المضادة أو لا تعمل في تحييد الفيروس في الاختبارات HAI وMN. ومع ذلك، تتطلب اختبارات HAI وMN ثقافة فيروس حية مع ما يرتبط بذلك من حاجة إلى مرافق متخصصة مع خزانات عالية المستوى للسلامة البيولوجية لاختبار الأجسام المضادة ضد الأنواع الفرعية من الأنفلونزا الطيور، في حين أن الصفيف الدقيق للبروتين لا ينطوي على فيروس حي المكونات بحيث يمكن استخدامها في أي مختبر أساسي. فيما يتعلق بحركية الربط، يتم تخفيف واحد من المصل الذي تم فحصه بصفيف يحتوي على تركيز واحد لكل مستضد ينتج نقطة بيانات واحدة، والتي تمثل مركبًا من الكمية والتقارب الذي تم تلخيصه على جميع الأجسام المضادة التي ترتبط بالمستضد . لحل كامل الحركية ملزمة الأجسام المضادة مستضد، مطلوب تركيزات مستضد متعددة و / أو تخفيف تسلسلي من سيرا.
وعلى الرغم من هذه القيود، فإن الصفيف الدقيق لمستضد الأنفلونزا هو أداة مفيدة لتوصيف اتساع الأجسام المضادة للأنفلونزا عبر المناظر الطبيعية المضادة للجينات التي يمكن أن تكمل الاختبارات الوظيفية التي هي أكثر محدودية من حيث الإنتاجية والتوافر.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن ينوه بالبروفيسور دون ميلتون (معهد الصحة العامة التطبيقية، جامعة ماريلاند، كوليدج بارك، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمعه السيرا البشرية بموجب بروتوكول IRB لجامعة ماريلاند #313842 بتمويل من DARPA N66001-18-2-4015 P00001. كما يود المؤلفون أن ينوه بالبروفيسور فلوريان كرامر (كلية إيكان للطب، جبل سيناء، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية) لتوفير مستضدات من نوع HA وNA ممولة من قبل ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. خان بدعم جزئي من المركز الوطني لموارد البحوث والمركز الوطني للنهوض بعلوم الترجمة، المعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة KL2 TR001416. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للصحة.
Materials
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
