Summary

Realización de Xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes

Published: September 16, 2019
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Summary

Las enfermedades humanas complejas pueden ser difíciles de modelar en los sistemas de modelos de laboratorio tradicionales. Aquí, describimos un enfoque quirúrgico para modelar la enfermedad muscular humana a través del trasplante de biopsias musculares esqueléticas humanas en ratones inmunodeficientes.

Abstract

Los efectos del tratamiento observados en estudios con animales a menudo no se recapitulan en ensayos clínicos. Si bien este problema es multifacético, una de las razones de este fallo es el uso de modelos de laboratorio inadecuados. Es difícil modelar enfermedades humanas complejas en organismos de laboratorio tradicionales, pero esta cuestión puede eludirse mediante el estudio de xenoinjertos humanos. El método quirúrgico que describimos aquí permite la creación de xenoinjertos musculares esqueléticos humanos, que se pueden utilizar para modelar la enfermedad muscular y para llevar a cabo pruebas terapéuticas preclínicas. Bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB), las muestras de músculo esquelético se adquieren de los pacientes y luego se trasplantan en ratones huésped NOD-Rag1nullIL2r. Estos ratones son huéspedes ideales para estudios de trasplante debido a su incapacidad para producir linfocitos maduros y, por lo tanto, son incapaces de desarrollar respuestas inmunitarias adaptativas mediadas por células y humorales. Los ratones huésped son anestesiados con isoflurano, y se eliminan los músculos del ratón tibialis anterior y digitorum longus extensor. Luego se coloca un pedazo de músculo humano en el compartimento tibial vacío y se sutura a los tendones proximales y distales del músculo peroneus longus. El músculo xenoinjerado es vascularizado e inervado espontáneamente por el huésped del ratón, lo que resulta en un músculo humano robusto mente regenerado que puede servir como modelo para estudios preclínicos.

Introduction

Se ha informado que sólo 13.8% de todos los programas de desarrollo de fármacos sometidos a ensayos clínicos son exitosos y conducen a terapias aprobadas1. Si bien esta tasa de éxito es superior al 10,4% reportado anteriormente2, todavía hay un margen significativo de mejora. Un enfoque para aumentar la tasa de éxito de los ensayos clínicos es mejorar los modelos de laboratorio utilizados en la investigación preclínica. La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) requiere estudios en animales para mostrar la eficacia del tratamiento y evaluar la toxicidad antes de los ensayos clínicos de fase 1. Sin embargo, a menudo hay una concordancia limitada en los resultados del tratamiento entre los estudios en animales y los ensayos clínicos3. Además, la necesidad de estudios preclínicos en animales puede ser una barrera insuperable para el desarrollo terapéutico en enfermedades que carecen de un modelo animal aceptado, que a menudo es el caso de enfermedades raras o esporádicas.

Una forma de modelar enfermedades humanas es trasplantando tejido humano en ratones inmunodeficientes para generar xenoinjertos. Hay tres ventajas clave para los modelos de xenoinjerto: en primer lugar, pueden recapitular las complejas anomalías genéticas y epigenéticas que existen en la enfermedad humana que pueden nunca ser reproducibles en otros modelos animales. En segundo lugar, los xenoinjertos se pueden utilizar para modelar enfermedades raras o esporádicas si hay muestras de pacientes disponibles. En tercer lugar, los xenoinjertos modelan la enfermedad dentro de un sistema in vivo completo. Por estas razones, hipotetizar que los resultados de eficacia del tratamiento en modelos de xenoinjerto son más propensos a traducirse en ensayos en pacientes. Los xenoinjertos tumorales humanos ya se han utilizado con éxito para desarrollar tratamientos para cánceres comunes, incluyendo mieloma múltiple, así como terapias personalizadas para pacientes individuales4,5,6, 7.

Recientemente, xenoinjertos se han utilizado para desarrollar un modelo de enfermedad muscular humana8. En este modelo, las muestras de biopsia muscular humana se trasplantan en las extremidades posteriores de ratones NRG inmunodeficientes para formar xenoinjertos. Las miofibers humanas trasplantadas mueren, pero las células madre musculares humanas presentes en el xenoinjerto posteriormente se expanden y diferencian en nuevas miofibers humanas que repoblan la lámina basal humana injertada. Por lo tanto, las miofibers regeneradas en estos xenoinjertos son completamente humanas y son espontáneamente revascularizadas e inervadas por el huésped del ratón. Es importante destacar que el tejido muscular del paciente trasplantado en ratones recapitula las características clave de la enfermedad humana, a saber, la expresión del factor de transcripción DUX4 8. La FSHD es causada por la sobreexpresión de DUX4, que se silencia epigenéticamente en el tejido muscular normal9,10. En el modelo de xenoinjerto FSHD, se ha demostrado que el tratamiento con un mortorfino específico de DUX4 reprime con éxito la expresión y la función de DUX4, y puede ser una opción terapéutica potencial para los pacientes con FSHD11. Estos resultados demuestran que los xenoinjertos musculares humanos son un nuevo enfoque para modelar la enfermedad muscular humana y probar posibles terapias en ratones. Aquí, describimos en detalle el método quirúrgico para crear xenoinjertos musculares esqueléticos humanos en ratones inmunodeficientes.

Protocol

Todo uso de especímenes de investigación de sujetos humanos fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Johns Hopkins (IRB) para proteger los derechos y el bienestar de los participantes. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (IACUC) de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones host nulantes (NRG) no-varones NOD-Rag1…

Representative Results

Como lo demuestra Yuanfan Zhang et al., este protocolo quirúrgico es un método sencillo para producir xenoinjertos de músculo esquelético humano8. Los xenoinjertos regenerados se inerten espontáneamente y muestran contractilidad funcional. Además, el xenoinjerto muscular de pacientes con FSHD recapitula los cambios en la expresión génica observados en pacientes con FSHD8. En nuestra experiencia, aproximadamente 7 de los 8 xenoinjertos rea…

Discussion

Los xenoinjertos derivados del paciente son una forma innovadora de modelar la enfermedad muscular y llevar a cabo estudios preclínicos. El método descrito aquí para crear xenoinjertos musculares esqueléticos es rápido, sencillo y reproducible. Las cirugías unilaterales se pueden realizar en 15 a 25 minutos, o bilateralmente en 30 a 40 minutos. Los xenoinjertos bilaterales pueden proporcionar flexibilidad experimental adicional. Por ejemplo, los investigadores pueden realizar un tratamiento localizado de un xenoinj…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Myositis y la Fundación Peter Buck. Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Yuanfan Zhang por compartir su experiencia y formación en la técnica quirúrgica de xenoinjerto.

Materials

100 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific FB0875712
2-Methylbutane Fisher O3551-4
20 x 30 mm micro cover glass VWR 48393-151
Animal Weighing Scale Kent Scientific SCL- 1015
Antibiotic-Antimycotic Solution Corning, Cellgro 30-004-CI
AutoClip System F.S.T 12020-00
Castroviejo Needle Holder F.S.T 12565-14
Chick embryo extract Accurate CE650TL
CM1860 UV cryostat Leica Biosystems CM1860UV
Coplin staining jar Thermo Scientific 19-4
Dissection Pins Fisher Scientific S13976
Dry Ice – pellet Fisher Scientific NC9584462
Embryonic Myosin antibody DSHB F1.652 recommended concentration 1:10
Ethanol Fisher Scientific 459836
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30071.01
Fiber-Lite MI-150 Dolan-Jenner Mi-150
Forceps F.S.T 11295-20
Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-21121 recommended concentration 1:500
Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 Invitrogen A-21145 recommended concentration 1:500
Gum tragacanth Sigma G1128
Hams F-10 Medium Corning 10-070-CV
Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive Tissue seal TS1050044FP
Human specific lamin A/C antibody Abcam ab40567 recommended concentration 1:50-1:100
Human specific spectrin antibody Leica Biosystems NCLSPEC1 recommended concentration 1:20-1:100
Induction Chamber VetEquip 941444
Iris Forceps F.S.T 11066-07
Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) Envigo TD.06596 Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections
Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Kimwipes Kimberly-Clark 34155 surgical wipes
Mapleson E Breathing Circuit VetEquip 921412
Methanol Fisher Scientific A412
Mobile Anesthesia Machine VetEquip 901805
Mouse on Mouse Basic Kit Vector Laboratories BMK-2202 mouse IgG blocking reagent
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
NAIR Hair remover lotion/oil Fisher Scientific NC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice The Jackson Laboratory 007799 2 to 3 months old
O.C.T. Compound Fisher Scientific 23-730-571
Oxygen Airgas OX USPEA
PBS (phosphate buffered saline) buffer Fisher Scientific 4870500
Povidone Iodine Prep Solution Dynarex 1415
ProLong™ Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)
Puralube Ophthalmic Ointment Dechra 17033-211-38
Rimadyl (carprofen) injectable Patterson Veterinary 10000319 surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg
Scalpel Blades – #11 F.S.T 10011-00
Scalpel Handle – #3 F.S.T 10003-12
Stereo Microscope Accu-scope 3075
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle Covidien VP-706-X
1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) BD Biosciences 329412
Trimmer Kent Scientific CL9990-KIT
Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge F.S.T 15009-08
VaporGaurd Activated Charcoal Filter VetEquip 931401
Wound clips, 9 mm F.S.T 12022-09

References

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Cite This Article
Britson, K. A., Black, A. D., Wagner, K. R., Lloyd, T. E. Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (151), e59966, doi:10.3791/59966 (2019).

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