ביצוע שריר השלד האנושי Xenografts בעכברים חיסוני
Summary
מחלות אנושיות מורכבות יכול להיות מאתגר למודל במערכות מסורתיות דגם מעבדה. כאן, אנו מתארים גישה כירורגית למודל מחלת שריר האדם באמצעות השתלת ביופסיות שריר השלד האנושי לתוך עכברים לקויה.
Abstract
תופעות הטיפול שנצפו במחקרים בעלי חיים לעתים קרובות אינן מצליחות להיות מיובחנות בניסויים קליניים. בעוד בעיה זו היא רבת פנים, סיבה אחת לכישלון זה הוא השימוש במודלים מעבדה לקוי. הוא מאתגר לדגם מחלות אנושיות מורכבות באורגניזמים המעבדה המסורתית, אבל בעיה זו ניתן להקיף באמצעות לימוד של האדם xenografts. השיטה הכירורגית שאנו מתארים כאן מאפשר יצירה של שתלי השלד האדם שרירים xenografts אשר ניתן להשתמש מודל מחלת שרירים לבצע בדיקות טיפוליות טרום קלינית. תחת הלוח סקירה מוסדית (IRB)-פרוטוקול מאושר, דגימות שריר השלד נרכשים מחולים ולאחר מכן מושתלים לתוך נוד-Rag1nullIL2rγnull (NRG) מארח עכברים. עכברים אלה הם מארחים אידיאליים עבור לימודי השתלת בשל חוסר היכולת שלהם להפוך לימפוציטים בוגרת ולכן אינם מסוגלים לפתח תא בתיווך ותגובות החיסונית מוסרית הסתגלות. עכברים מארחים מרדימים עם isof, והשרירים הקדמית ופושט המים הקדמי מוסרים. חלק משריר האדם מוצב לאחר מכן בתוך תא השוקה הריק והוא מונח אל הגידים האבוקיים והמרוחק של השריר הארוך ביותר. השריר מושתל באופן ספונטני ומinnervated על ידי מארח העכבר, וכתוצאה מכך שריר האדם מחדש מכבש שיכול לשמש כמודל למחקרים פרה-קליניים.
Introduction
דווח כי רק 13.8% של כל תוכניות פיתוח הסמים שעברו ניסויים קליניים מצליחים להוביל טיפולים שאושרו1. בעוד ששיעור הצלחה זה גבוה יותר מ-10.4% שדווחו בעבר2, יש עדיין מקום משמעותי לשיפור. גישה אחת כדי להגדיל את שיעור ההצלחה של ניסויים קליניים היא לשפר את דגמי המעבדה המשמשים במחקר טרום קליני. מינהל המזון והתרופות (FDA) דורש מחקרים בעלי חיים כדי להפגין יעילות טיפול ולהעריך רעילות לפני שלב 1 ניסויים קליניים. עם זאת, לעתים קרובות יש קונקורדנציה מוגבלת בתוצאות הטיפול בין לימודי בעלי חיים וניסויים קליניים3. בנוסף, הצורך בלימודי בעלי חיים פרה-קליניים יכול להיות מכשול בלתי ניתן להתפתחות טיפולית במחלות שאין בהן מודל בעל חיים מקובל, שלעיתים קרובות מדובר במחלות נדירות או מפוזרות.
אחת הדרכים למודל מחלת האדם היא על ידי שתילת רקמת האדם לתוך עכברים לקוי כדי לייצר שתלי xenografts ישנם שלושה יתרונות מרכזיים ל מבע מודלים: הראשון, הם יכולים ללכוד את העיוותים גנטית מורכבים אפיגנטיים הקיימים במחלה האנושית, כי ייתכן שלעולם לא להיות מיוכל במודלים של בעלי חיים אחרים. שנית, ניתן להשתמש ב-xenografts כדי לדגמן מחלות נדירות או מפוזרות אם דגימות החולה זמינות. שלישית, xenografts תלי מודל המחלה בתוך מערכת שלמה vivo. מסיבות אלה, אנו ההשערה כי הטיפול תוצאות יעילות במודלים מבע נוטים יותר לתרגם ניסויים בחולים. האדם xenografts תלי הגידול כבר מנוצל בהצלחה כדי לפתח טיפולים עבור סוגי סרטן נפוצים, כולל מיאלומה נפוצה, כמו גם טיפולים אישיים עבור חולים בודדים4,5,6, 7. לאחר מכן
לאחרונה, xenografts שימשו כדי לפתח מודל של מחלת שריר האדם8. במודל זה, דגימות של ביופסיה של האדם האנושי מושתלים לתוך הגפיים של העכברים NRG לקויה ליצור שתלי xenografts הזרע מיושתלים האדם למות, אבל תאי גזע השריר האנושי הנוכחים בשתל מבע אחר מכן להרחיב ולהבדיל לסיבים האנושי החדש אשר מאכלס את הבסיס האנושי מנופה של האדם. לכן, הסיבים הנוצרות מחדש ב-xenografts אלה הם אנושיים לחלוטין, הם באופן ספונטני revascularized על ידי מארח העכבר. חשוב מכך, ניוון שרירים fascioscapulohumeral (FSHD) רקמת שריר החולה המושתלים לתוך עכברים לכידה של תכונות מפתח של המחלה האנושית, כלומר ביטוי של הגורם שעתוק DUX4 8. Fshd נגרמת על ידי הבעות יתר של DUX4, אשר מושתק גנטית ברקמת שריר נורמלי9,10. במודל fshd מבע, טיפול עם DUX4 olino מסוים הוכח לדכא בהצלחה DUX4 ביטוי ותפקוד, והוא עשוי להיות אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור חולים fshd11. תוצאות אלה מציגות כי שרירי האדם xenografts הם גישה חדשה למודל מחלת שרירים אנושית ולבדוק טיפולים פוטנציאליים עכברים. כאן, אנו מתארים בפירוט את השיטה כירורגית ליצירת שרירי השלד האנושי xenografts בעכברים חיסוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטופל נגזר שתלי xenografts דרך חדשנית למודל מחלת שרירים ולבצע מחקרים טרום קליניים. השיטה המתוארת כאן כדי ליצור שתלי השלד xenografts מהירה, ישירה, ו להיות מנויית. ניתוחים חד צדדיים ניתן לבצע בתוך 15 עד 25 דקות, או בקיעים בתוך 30 עד 40 דקות. שתלי הדו הדו-צדדיים יכולים לספק גמישות ניסויית נוספת. למשל, החוקרי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי עמותת מיאוסיטיס וקרן פיטר באק. ברצוני להודות לד ר יואן-פן ג’אנג על שיתוף המומחיות וההכשרה שלה בטכניקת הכירורגיה הכירורגית.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
