Het uitvoeren van menselijke skeletspieren xenografts in Immunodeficiënte muizen
Summary
Complexe menselijke ziekten kunnen lastig zijn om te modelleren in traditionele laboratoriummodel systemen. Hier beschrijven we een chirurgische benadering om de menselijke spierziekte te modelleren door de transplantatie van menselijke skeletspier biopsieën in immunodeficiënte muizen.
Abstract
De in dierstudies waargenomen behandelingseffecten worden vaak niet in klinisch onderzoek gerecapitculeerd. Hoewel dit probleem veelzijdig is, is een van de redenen voor deze mislukking het gebruik van inadequate laboratorium modellen. Het is een uitdaging om complexe menselijke ziekten in traditionele laboratorium organismen te modelleren, maar dit probleem kan worden omzeild door de studie van menselijke xenografts. De chirurgische methode die we hier beschrijven, zorgt voor de creatie van menselijke skeletspieren xenografts, die kunnen worden gebruikt om spierziekte te modelleren en om preklinische therapeutische testen uit te voeren. Onder een institutioneel Review Board (IRB)-goedgekeurd protocol, worden skeletspieren specimens verworven van patiënten en vervolgens getransplanteerd in NOD-Rag1NullIL2rγNull (NRG) host muizen. Deze muizen zijn ideale gastheren voor transplantatie studies als gevolg van hun onvermogen om volwassen lymfocyten te maken en zijn dus niet in staat om cel-gemedieerde en humorale adaptieve immuunresponsen te ontwikkelen. Hostmuizen worden verdoofd met Isofluraan en de muis tibialis voorste en extensor digitorum Longus spieren worden verwijderd. Vervolgens wordt een stukje menselijke spier in het lege tibiale compartiment geplaatst en gehecht aan de proximale en distale pezen van de peroneus longus spier. De xenografted spier is spontaan gevasculariseerde en geïncubeerd door de muis gastheer, resulterend in robuust geregenereerde menselijke spier die kan dienen als een model voor preklinische studies.
Introduction
Er is gemeld dat slechts 13,8% van alle Programma’s voor Geneesmiddelenontwikkeling die klinische proeven ondergaan succesvol zijn en leiden tot goedgekeurde therapieën1. Hoewel dit succespercentage hoger is dan de 10,4% eerder gerapporteerde2, is er nog steeds aanzienlijke ruimte voor verbetering. Een benadering om het succespercentage van klinische proeven te verhogen is het verbeteren van laboratorium modellen die worden gebruikt in preklinisch onderzoek. De Food and Drug Administration (FDA) vereist dierstudies om de werkzaamheid van de behandeling te tonen en de toxiciteit te beoordelen voorafgaand aan fase 1 klinische onderzoeken. Er is echter vaak een beperkte concordantie in behandelingsresultaten tussen dierstudies en klinische proeven3. Bovendien kan de noodzaak van preklinische dierproeven een onoverkomelijke barrière zijn voor therapeutische ontwikkeling bij ziekten die geen geaccepteerd diermodel hebben, wat vaak het geval is bij zeldzame of sporadische ziekten.
Een manier om het model van menselijke ziekte is door het transplanteren van menselijk weefsel in immunodeficiënte muizen om xenografts te genereren. Er zijn drie belangrijke voordelen voor xenotransplantaatmodellen is-modellen: ten eerste kunnen ze de complexe genetische en epigenetische afwijkingen die in een menselijke ziekte voorkomen, die nooit reproduceerbaar zijn in andere diermodellen, recapituleren. Ten tweede kunnen xenotransplantaten worden gebruikt om zeldzame of sporadische ziekten te modelleren als er patiënt monsters beschikbaar zijn. Ten derde modelleren xenotransplantaten de ziekte binnen een compleet in vivo systeem. Om deze redenen veronderstellen we dat de werkzaamheidsresultaten van de behandeling in xenotransplantaatmodellen is-modellen meer kans maken om te vertalen naar proeven bij patiënten. Menselijke tumor xenotransplantaten zijn al met succes gebruikt voor het ontwikkelen van behandelingen voor veelvoorkomende kankers, met inbegrip van multipel myeloom, evenals gepersonaliseerde therapieën voor individuele patiënten4,5,6, 7.
Onlangs zijn xenotransplantaten gebruikt voor de ontwikkeling van een model van de menselijke spierziekte8. In dit model worden menselijke spier biopsie specimens in de achterbenen van immunodeficiënte NRG muizen getransplanteerd om xenografts te vormen. De getransplanteerde humane myofibers sterven, maar menselijke spier stamcellen aanwezig in de xenotransplantaatmodellen is vervolgens uit te breiden en te differentiëren in nieuwe menselijke myofibers die herbevolken de geënt menselijke basale lamina. Daarom zijn de geregenereerde myovezels in deze xenotransplantaten volledig menselijk en worden ze spontaan revasculariseerd en geïnnerveerd door de muis gastheer. Belangrijker, fascioscapulohumeral spierdystrofie (FSHD) patiënt spierweefsel getransplanteerd in muizen aan belangrijkste kenmerken van de menselijke ziekte, namelijk de uitdrukking van de Dux4 transcriptiefactor8. FSHD wordt veroorzaakt door overexpressie van Dux4, wat epigenetisch wordt onderdrukt in normaal spierweefsel9,10. In het FSHD xenotransplantaatmodellen is-model is aangetoond dat behandeling met een Dux4-specifieke morpholino met succes Dux4 expressie en functie te onderdrukken en mogelijk een mogelijke therapeutische optie is voor FSHD-patiënten11. Deze resultaten tonen aan dat menselijke spier xenotransplantaten een nieuwe benadering zijn om de menselijke spierziekte te modelleren en mogelijke therapieën bij muizen te testen. Hier beschrijven we in detail de chirurgische methode voor het maken van menselijke skeletspieren xenotransplantaten in immunodeficiënte muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patiënt-afgeleide xenotransplantaten zijn een innovatieve manier om te modelleren spierziekte en preklinische studies uitvoeren. De hier beschreven methode om skeletspieren xenotransplantaten maken is snel, ongecompliceerd, en reproduceerbaar. Eenzijdige operaties kunnen worden uitgevoerd in 15 tot 25 minuten, of bilateraal in 30 tot 40 minuten. Bilaterale xenotransplantaten kunnen extra experimentele flexibiliteit bieden. Onderzoekers kunnen bijvoorbeeld een gelokaliseerde behandeling van een xenograft uitvoeren, met d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de myositis Association en de Peter Buck Foundation. We willen Dr. yuanfan Zhang graag bedanken voor het delen van haar expertise en training in de xenotransplantaatmodellen is chirurgische techniek.
Materials
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 20 x 30 mm micro cover glass | VWR | 48393-151 | |
| Animal Weighing Scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning, Cellgro | 30-004-CI | |
| AutoClip System | F.S.T | 12020-00 | |
| Castroviejo Needle Holder | F.S.T | 12565-14 | |
| Chick embryo extract | Accurate | CE650TL | |
| CM1860 UV cryostat | Leica Biosystems | CM1860UV | |
| Coplin staining jar | Thermo Scientific | 19-4 | |
| Dissection Pins | Fisher Scientific | S13976 | |
| Dry Ice – pellet | Fisher Scientific | NC9584462 | |
| Embryonic Myosin antibody | DSHB | F1.652 | recommended concentration 1:10 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 459836 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Fiber-Lite MI-150 | Dolan-Jenner | Mi-150 | |
| Forceps | F.S.T | 11295-20 | |
| Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21121 | recommended concentration 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594 | Invitrogen | A-21145 | recommended concentration 1:500 |
| Gum tragacanth | Sigma | G1128 | |
| Hams F-10 Medium | Corning | 10-070-CV | |
| Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive | Tissue seal | TS1050044FP | |
| Human specific lamin A/C antibody | Abcam | ab40567 | recommended concentration 1:50-1:100 |
| Human specific spectrin antibody | Leica Biosystems | NCLSPEC1 | recommended concentration 1:20-1:100 |
| Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
| Iris Forceps | F.S.T | 11066-07 | |
| Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm) | Envigo | TD.06596 | Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | surgical wipes |
| Mapleson E Breathing Circuit | VetEquip | 921412 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Mobile Anesthesia Machine | VetEquip | 901805 | |
| Mouse on Mouse Basic Kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | mouse IgG blocking reagent |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice | The Jackson Laboratory | 007799 | 2 to 3 months old |
| O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Oxygen | Airgas | OX USPEA | |
| PBS (phosphate buffered saline) buffer | Fisher Scientific | 4870500 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI) | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Rimadyl (carprofen) injectable | Patterson Veterinary | 10000319 | surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5mg/kg |
| Scalpel Blades – #11 | F.S.T | 10011-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | F.S.T | 10003-12 | |
| Stereo Microscope | Accu-scope | 3075 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle | Covidien | VP-706-X | |
| 1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle) | BD Biosciences | 329412 | |
| Trimmer | Kent Scientific | CL9990-KIT | |
| Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge | F.S.T | 15009-08 | |
| VaporGaurd Activated Charcoal Filter | VetEquip | 931401 | |
| Wound clips, 9 mm | F.S.T | 12022-09 |
References
- Wong, C. H., Siah, K. W., Lo, A. W. Estimation of clinical trial success rates and related parameters. Biostatistics. , 1-14 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, 40-51 (2014).
- Perel, P., et al. Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. BMJ. 334, 1-6 (2007).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology Therapeutics. 85, 217-221 (2009).
- Roberts, K. G., et al. Targetable Kinase-Activating Lesions in Ph-like Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 371, 1005-1015 (2014).
- Kim, J., et al. GDF11 Controls the Timing of Progenitor Cell Competence in Developing Retina. Science. 308, 1927-1930 (2005).
- Sako, D., et al. Characterization of the ligand binding functionality of the extracellular domain of activin receptor type IIB. Journal of Biological Chemisty. 285, 21037-21048 (2010).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Human Molecular Genetics. 23, 3180-3188 (2014).
- Gabellini, D., Green, M. R., Tupler, R. Inappropriate Gene Activation in FSHD : A Repressor Complex Binds a Chromosomal Repeat Deleted in Dystrophic Muscle. Cell. 110, 339-348 (2002).
- Lemmers, R. J. L. F., et al. A Unifying Genetic Model for Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy. Science. 329, 1650-1654 (2010).
- Chen, J. C. J., et al. Morpholino-mediated Knockdown of DUX4 Toward Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy Therapeutics. Molecular Therapy. 24, 1405-1411 (2016).
- Medical Research Council. . Aids to the investigation of the peripheral nervous system. , (1943).
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21, 2348-2356 (2017).
