Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi
1MRC Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh, 2UCL Great Ormond Street Institute of Child Health,University College London, 3Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences,Brunel University London, 4School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute,Trinity College Dublin
Summary
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerden tanımlanan kültür sistemi ve hücre kendi kendine montaj kullanarak hepatospheres üretmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu protokol, hücre çizgilerinin bir dizi tekrarlanabilir, maliyet etkili ve Biyomedikal uygulama için istikrarlı insan hepatospheres üretimi sağlar.
Abstract
Hücre bazlı modelleme geliştirmek ve transplantasyon için insan dokusu geliştirmek için karaciğer dokusu yenilenebilir kaynakların geliştirilmesi gereklidir. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) insan karaciğer küreler umut verici kaynakları temsil eder. Biz insan pluripotent kök hücrelerinden oluşan üç boyutlu insan karaciğer küreler oluşturmak için hücresel farklılaşma bir serum ücretsiz ve tanımlanmış bir yöntem geliştirdik. Teknolojinin potansiyel bir sınırlama içinde ölü malzeme ile yoğun küreler üretimi. Bunu aşmak için, 3 boyutlu kürenin boyutunu kontrol etmek için tanımlanan hücre yoğunluklarında agaroz mikrowell teknolojisini istihdam ettik, apoptotik ve/veya nekrotik çekirdeğin oluşumunu önler. Özellikle, yaklaşım görüntüleme karaciğer fonksiyonu ve istikrarlı fenotip tarafından oluşturulan küreler, temel ve uygulamalı bilimsel araştırmalar için değerli bir kaynak temsil eder. Yaklaşımımızın, insan hastalığının modeline ve tedavisinde daha fazla doku geliştirmek için bir platform teknolojisi olarak kullanılabileceğini ve gelecekte karmaşık doku mimarisi ile insan dokusu üretmesine izin verebilecegine inanıyoruz.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücrelerinin yeteneği (hPSCs) kendi kendine yenilemek, iken pluripotency koruyarak, talep üzerine insan hücresi türleri ve dokulara üretmek için bir fırsat sağlar. hpscs iki boyutlu (2D) yapışmış kültür sistemleri1,2,3,4,5,6 kullanarak hepatosit benzeri hücrelere (hlcs) verimli bir şekilde ayırt edilmiştir ,7,8,9,10. Bu sistemler, monojenik hastalık, virüs yaşam döngüsü, ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (DILI), toksinler ve alkollü olmayan yağlı karaciğer hastalığı fetal maruz kalma (NAFLD) başarıyla model için kullanılmıştır11,12,13 ,14,15. Ancak, bu modellerin rutin kullanımını sınırlamak bazı dezavantajları, sahip. Bunlar arasında fetal Marker ifadesi, kararsız fenotip ve kötü doku mimarisi16,17,18,19, ayrıca organ fonksiyonuna extrapolasyonu kısıtlayabilen in vivo.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, üç boyutlu (3D) farklılaşma platformları in vivo doku mimarisi taklit etmek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar etkinleştirme olmasına rağmen, hayvan türevi ürünler ve Matrislerin doku Genesis20,21,22, ölçek-up ve yaygın uygulama sınırlama sürücü kullanımına güveniyor.
Burada, biz detay yordamları kullanarak hPSCs 3D hepatospheres büyük miktarlarda oluşturmak için tanımlanan malzemeler ve hücre Self-montaj. Özellikle, bizim prosedür tarafından oluşturulan doku hücre kültüründe bir yıldan fazla işlevsel kalır ve içinde vivo23karaciğer fonksiyonunu destekleyen yeteneğine sahiptir.
Özetle, tanımlanmış farklılaşma yaklaşımımız, hem insan embriyonik kök hücrelerinden (hESCs) hem de indüklenen pluripotent kök hücrelerinden (ıpscs) istikrarlı insan hepatokürlerin oluşturulmasını sağlar. Biz açıklanan prosedür temel ve uygulamalı bilimsel araştırmalar için 3D hepatospheres nesil önemli bir atılım temsil inanıyoruz.
Protocol
1. Agarose Mikroplaka kalıpları hazırlanması Not: Bu deneyler için kullanılan medya hücre kültürü için steril ve oda sıcaklığında (RT) olmalıdır. Hazırlamak 2% agaroz kalıplar. 2 g düşük erime sıcaklığı agaroz 100 ml sterilize distile su içine çözülür. Dikkatle tamamen çözülmek için sallayarak aralığı ile bir mikrodalga ısıtın. 256-Well formatlı bir kalıp için eritilmiş agaroz 520 μL ekleyin ve katılaşma için bırakın. Her agaroz mikroplakasını 12-kuyu plakasının tek bir kuyunda aktarın. Eklemek 1,5 mL 1x Dulbecco fosfat-tamponlu tuz (DPBS) ile CA2 +/mg2 + her iyi ve yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez bir P1000 pipet ucu kullanarak pipetleme ile mikrokuyulardan hava kabarcıkları çıkarın. Bu Tekdüzen hücre tohumlama sağlamak için gerçekleştirilir.Not: Agarose mikroplakaları 4 °C ‘ de 1x DPBS ‘de 6 aya kadar saklanabilir. 2. Agarose Microwell plakaları içine ınsan pluripotent kök hücreleri tohumlama Hücre süspansiyonunun hazırlanması Daha önce8açıklandığı gibi hpscs farklılaşmamış bir kültürden orta aspirate.Not: Hpscs MTESR1 içinde LN-521 kültür her 24 saat değiştirildi ve düzenli olarak bir kez hücreler ulaşmak% 75%% 85 konfluency kadar önceden açıklanan8. CA2 +/mg2 + olmadan 5 ml RT 1x dpbs ile hücreleri durulayın ve tamponu çıkarın. Hücrelere 5 mL 1x hücreli disajasyon reaktörlerini (malzeme tablosu) ekleyin ve 37 °c ‘ de 6-8 dakika boyunca hücreler inkübasyon yaparak hücre dağılmasına izin verin.Not: Reaksiyonu durdurmak için, mikroskop altında hücre dekolmanı inceleyin. Hücreler kısmen plakaya ayrılabilir. Daha uzun süre gerekiyorsa, ek 1-2 dk için inkübasyon genişletin. Hücre dağılma reaksiyonunu kaldırarak reaksiyonu durdurun ve 10 μM Rho ile ilişkili kinaz (kaya) inhibitörü Y27632 hücrelere 5 mL taze mTeSR1 orta ekleyin. Bir P1000 pipet ucu kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri ayırmak. Bir hemokytometer ve tripan mavi boyama dışlama kullanarak uygun hücreleri saymak. Bunun ardından, hücre süspansiyonunu gerekli konsantrasyonda hazırlayın. Gereken toplam hücre sayısını hesaplayın. 3D hepatosphere farklılaşma için, Seed 3,84 x 105 hücreleri agaroz Mikroplaka başına 100-150 μm ile küroidler üretmek için çapı. Hücre istenilen sayıda steril bir 15 ml veya 50 ml Santrifüjü tüp aktarmak ve 200 x g için tüp santrifüjler 5 dk RT içinde hücreleri Pelet için. MTeSR1 orta artı 10 μM kaya inhibitörü Y27632 süpernatant ve pelletini hücrelerini aspirate ve atın. 2,1 x 106 hücreler/ml son konsantrasyonuna orta uygun hacimli hücre Pelet seyreltmeli. Hücreleri hazırlanmış agaroz mikroplakalarına tohumlamaNot: buzdolaplı agaroz mikroplakalarını kullanıyorsanız, onları 37 °c ‘ de hücre kuluçta kullanmak için en az bir saat önce yerleştirin ve 1x dpbs ‘i hücre tohumunun öncesinde iyi bir şekilde aspire edin. 190, hücre süspansiyonunun μL değerini agaroz mikrokuyu içine ekleyin. Tohumlama sonra, 37 °C ve 5% CO2 için hücreler yerleşmek izin vermek için 2 h hücre kuluçk plakaları dönün. 2 saat sonra, her iyi 10 μM kaya inhibitörü Y27632 ile tamamlayıcı 1 mL taze ve sıcak mTeSR1 orta ekleyin. 37 °C ve% 5 CO2 için 24 saat içinde hücre inkükobilerine plakaları geri dönün ve hücrelerin eklenmesine izin vermek için ertesi gün kürlerin oluşumunu inceleyin. 3. Agarose Microwells on 3D Hepatospheres hPSCs ayrım Poly 2-hidroksietil metakrilgeç (poli-HEMA) kaplı kuyuların hazırlanması % 95 etanol 100 mL Poly-HEMA 2 g çözülür. 55 °C ‘ de sıcak plaka kullanarak solüsyonu gece karıştırın. Fırın kullanılarak 60 °C ‘ de 24 kuyu plaka ve kuru bir gecede 250 μL Poly-HEMA çözeltisi ekleyin. Farklılaşma ortamının hazırlanması Bir 1, 000x Stock çözüm insan aktivin, sterilizasyon, insan aktivasyonunda bir liyofilize protein steril 0,2% sığır serum albümin (BSA)/dpbs son konsantrasyon 100 μg/ml için hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. Steril 0,2% BSA/dpbs ‘de 10 μg/ml ‘lik son konsantrasyonda fare Wnt3a liyofilize protein çözünerek Wnt3a bir 1, 000x stok çözüm hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:200 de kullanın. İnsan Hepatosit büyüme faktörünün (HGF) steril 0,2% BSA/DPBS ‘de insan HGF likofilize proteini 10 μg/mL ‘Lik son konsantrasyonda çözünerek 1, 000x Stock çözeltisi hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. OSM ‘yi steril 0,2% BSA/DPBS ‘de 20 μg/mL ‘Lik son konsantrasyonda çözünerek, onstin M (OSM) 1, 000x stok çözeltisi hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. Epitel büyüme faktörünün (EGF) steril 0,2% BSA/DPBS ‘de likofilize proteini 10 μg/mL ‘Lik son konsantrasyonda çözerek 1000x Stock çözeltisi hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. 1, 000x Stock solüsyonu temel fibroblast büyüme faktörünün (bFGF) steril 0,2% BSA/DPBS ‘de likofilize proteinlerin son 10 μg/mL konsantrasyonunda çözülmesiyle hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. 0,2% BSA/DPBS ‘de likofilize proteini 10 μg/mL ‘Lik son konsantrasyona sökerek, vasküler endotel büyüme faktörünün (VEGF) 1, 000x stok çözümünü hazırlayın. Küçük aliquots-20 °C ‘ de saklayın. 1:1000 ‘ de kullanın. Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640) Bazal orta oluşan endoderm farklılaşma Orta 2% B27 takviyesi (50x, insülin olmadan), ve 1% penisilin/streptomisin (Final konsantrasyonları: 100 ıU/mL ve 100 μg/mL, sırasıyla). Belirtilen sürece, her Orta değişiklik, Wnt3a ve aktivin a son konsantrasyon 50 ng/ml ve 100 ng/ml, sırasıyla gerekli hacmi ek.Not: 4 °C ‘ de saklayın ve iki hafta içinde kullanın. % 20 nakavt serum değişimi (KOSR) ile nakavt Dulbecco modifiye kartal Orta (KO-DMEM) oluşan hepatoblast farklılaşma orta yapmak ve L-glutamin alternatif ek% 0,5 ile tamamlayıcı,% 1 olmayan esansiyel amino asitler (NEAA), 0,1 mM Beta-mercaptoetanol, 1% dimetil sülfoxid (DMSO), ve 1% penisilin/streptomisin (nihai konsantrasyonlar 100 ıU/mL ve 100 μg/mL, sırasıyla). Vakum altında filtre.Not: 4 °C ‘ de saklayın ve iki hafta içinde kullanın. Hepatosit olgunlaşma orta, L-glutamin, 10 μM hidrokortizon 21-hemisükcinat sodyum tuz (HCC), 1% penisilin/streptomisin (son konsantrasyonlarda 100 ıU/mL ve 100 sırasıyla μg/mL). Her orta değişim için, gerekli hacmi OSM ve HGF ile ek olarak (nihai konsantrasyonlar 20 ng/mL ve 10 ng/mL ‘Dir).Not: Stokları 4 °C ‘ de saklayın ve iki hafta içinde kullanın. William ‘ın E orta oluşan hepatosit bakım ortamı yapmak 10% nakavt serum yedek ile tamamlayıcı, L-glutamin alternatif ek% 1 oluşan, 1% penisilin/streptomisin (son konsantrasyonlarda 100 ıU/mL ve 100 μg/mL, sırasıyla). Her orta değişim için, HGF, EGF, bFGF ve VEGF (10 ng/mL ‘de her büyüme faktörünün son konsantrasyonu) ile gerekli hacmi ek.Not: Stokları 4 °C ‘ de saklayın ve iki hafta içinde kullanın. Hepatosphere oluşumu kontrol edin 24 h sonrası tohumlama ve hepanosit farklılaşma başlatın. Dikkatle mTeSR1 orta kaldırmak ve 100 ng/ml aktivin A ve 50 ng/ml Wnt3a ile tamamlayıcı taze endoderm farklılaşma orta 1 ml ile değiştirin. Değiştirme takviyesi endoderm emişli orta her 24 saat için 3 hescs için gün. Hipscs ile çalışırken, tek başına aktivin a (100ng/ml) ile medyayı tamamlayan daha 2 gün boyunca bu aşaması uzatın. Aşağıdaki kesin endoderm indüksiyon, hepatoblast farklılaşma orta için geçiş heratoblast özellikleri için 5 gün orta her 2 gün ve hepatoblast spesifikasyonunun son gününde son değişikliği gerçekleştirmek. Hepatospherleri Poly-HEMA kaplamalı kuyulara aktarın. KSR/DMSO ortamını kaldırdıktan sonra takviyeleri olmadan hepatosit olgunlaşma orta ile hücreleri bir kez yıkayın ve 10 ng/mL HGF ve 20 ng/mL OSM ile tamamlayıcı 1 mL hepatosit olgunlaşma orta ekleyin. , Bir P1000 pipet kullanarak, agaroz mikroplakasının hepatospheres yukarı ve aşağı birkaç kere çözüm pipetleme tarafından kaldırın. Hepatospherleri içeren ortamı Poly-HEMA kaplamalı bir kuyu ile aktarın. 10 ng/ml hgf ve 20 ng/ml OSM ile desteklenen 1 ml hepatosit olgunlaşma ortamını kullanarak agaroz mikroplakasını yıkayın ve orta tabakayı Poly-Hema kaplamalı kuyu ile aktarın. Agaroz Mikroplaka tüm hepatospheres aktarmak için mümkün olduğunca çok kez 3.6.4 adım tekrarlayın.Not: Onlara zarar vermemek için hepatospherleri içeren çözümün yukarı ve aşağı dikkatle pipet edilmesi önemlidir. Özenle aşırı orta hepatospheres bir P100 pipet kullanarak kaldırmadan Aspire kadar ~ 1 ml orta ikisi de Poly-Hema kaplı iyi kalan karaciğer içerir. 12 gün boyunca her 48 h orta değiştirin. 20. günde hESCs ya da 22. gün ile çalışırken hiPSCs ile çalışırken, orta hepatosit bakım ortamına geçin. Hepatosit olgunlaşma orta ve yıkama hücreleri bir kez, takviyeleri olmadan kendilerini bakım ortamı ile çıkarın. 10 ng/mL HGF, EGF, FGF ve VEGF ile tamamlayıcı 1 mL hepatosit bakım ortamını ekleyin. Taze hepatosit bakım orta her 48 h için orta değiştirin. 4. uzun süreli kültürlü 3D Hepatospheres fonksiyonel analizi 10 μM HCC, L-glutamin,% 1 penisilin/streptomisin (sırasıyla 100 ıU/mL ve 100 μg/mL ‘de son konsantrasyonlar) ve fonksiyonel analizinden önce 10 ng/mL HGF 48 h ile desteklenen hepatosit olgunlaşma ortamına geçin. Sitokrom (CYP) P450 asder kullanarak hepatosit metabolik fonksiyonunu analiz edin. Orta yerine 1 mL taze hepatosit olgunlaşma orta ile tamamlayıcı 50 μM Luciferin-6’-pentafluoro-Benzil eter (luciferin-PFBE) substrat CYP3A bazal aktivite veya 100 μM Luciferin-Metil Eter (luciferin-ME) tespit etmek için substrat CYP1A2 Bazal aktivite (çoğaltır sayısı = 3). Doku kültürü medyasını negatif kontrol olarak kullanın.Not: Çapraz reaktivite önlemek için, farklı CYP P450 faaliyetleri test etmek için ancak bireysel kuyuları bunları gerçekleştirmek için 3D hepatospheres içeren aynı kuyuları kullanmak için tavsiye edilmez. 37 ° C ‘de 24 saat boyunca hücreleri kulyın. Bir P100 pipet ucu kullanarak süpernatanlarında toplamak ve üreticinin talimatlarına göre tahlil yürütmek. Bazal aktivite göreli düzeylerini ölçmek ve bicinchoninik asit tahlil (BCA) tarafından belirlenen mg protein başına normalleştirmek. Enzim bağlantılı İmmünosorbent Assay (ELıSA) kullanarak test serum protein üretimi. 10 ng/mL HGF ve 20 ng/mL OSM (çoğaltır sayısı = 3) ile tamamlayıcı olarak 1 mL ‘Lik taze hepatosit olgunlaşma ortamına sahip bir ortam değiştirin. Doku kültürü medyasını negatif kontrol olarak kullanın. 37 ° C ‘de 24 saat boyunca hücreleri inkük. Bir P100 pipet ucu kullanarak süpernatant toplamak ve üreticinin talimatlarına göre serum protein üretiminin göreli düzeylerini ölçmek. BCA assay tarafından belirlenen mg protein başına normalleştirmek. 5. immünositokimya Hepatokürler içeren parafin bölümlerin hazırlanması. 1x DPBS ile hepatospherleri üç kez yıkayın. 30 dakika boyunca buz-soğuk metanol ile hepatospherleri düzeltin. 1x DPBS ile üç kez yıkayın. 300 μL içinde hepatospheres embed 2% agaroz bir temperli çözüm H2O bir kalıp olarak 24-kuyu plaka boş bir kuyu kullanarak çözünür ve 30 dakika boyunca katılaşma için bırakın. Parafin içinde hepatospherlar içeren agaroz katıştırın. Bir mikrotome kullanılarak 4 μm kalınlığında sabit hepatokürler içeren parafin bloğunun bölümlenmiştir. Bölümlerin de-ağda ve rehidrasyon.Not: mümkün olduğunda taze çözümler kullanın. Bir haftadan uzun süre boyama sırasında bulunan çözümleri kullanmayın. Bölümleri bir slayt rafa yerleştirin. 5 dakika boyunca 300 mL Ksilin içeren bir boyama dalında bölümler içeren slayt raf bırakın. 5.2.2 Adımını tekrarlayın. 20 s için mutlak etanol içine batırın. 20 s için% 95 etanol içine daldırın. 20 s için% 90 etanol içine daldırın. 20 s için% 80 etanol içine daldırın. 20 s için% 70 etanol içine daldırın. 5 dakika boyunca su ile bölümleri rehidrat.Not: Aynı slayt raf içinde slaytlar korumak ve bir sonraki bir boyama çukur taşıyın. Kullanılan hacim (genellikle ~ 300 mL) boyama Trough boyutuna bağlıdır. Hepatospheres içeren parafin bölümlerin antijen alımı. 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 tampon çözeltisi, 800 W ‘de bir mikrodalga fırın içinde 15 dakika boyunca ısı de-mumlu ve rehydrated bölümler. 5 dakika boyunca musluk suyuna daldırarak örnekleri soğutur. İmmün boyama. RT ‘de 1 h için 0,1% polisorbat 20 (PBS/T)/10% BSA ile PBS ‘den oluşan engelleme çözeltisi ile slaytlar kuluçta yapın. Engelleme çözümünü PBS/T/1% BSA ‘da seyreltilmiş uygun primer antikor ile değiştirin ve gece boyunca nazik ajitasyon ile 4 °C ‘ de inküye yapın. PBS/T ile hücreleri 5 dakika yıkayın ve üç kez tekrarlayın. PBS/T/1% BSA ‘da seyreltilmiş uygun ikincil antikor ile inkük ve hafif agitasyon ile 1 h için RT ‘de karanlıkta inküye yapın.Not: Optimum primer ve ikincil antikorlar malzeme tablosundalistelenmiştir. PBS/T ile hücreleri 5 dakika yıkayın ve üç kez tekrarlayın. Üreticinin talimatlarına göre hücrelere 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (dapi) ekleyin ve hava kabarcıklarını azaltmak için hafifçe cam lamel magazini yerleştirin. Sabit hücreleri karanlıkta 4 °C ‘ de tutun. Uygun filtre ve floresan lamba ile mikroskop altında boyama gözlemlemek.Not: görüntüleme kadar karanlıkta 4 °c ‘ de depo plakaları.
Representative Results
Embriyonik kök hücre hattı (H9) veya indüklenen pluripotent kök hücre hattı (P106) üç boyutlu toplamları bizim tanımlanmış prosedürü kullanarak hepatosit soy doğru ayırt edildi (Şekil 1). Pluripotent kök hücreleri ilk önce hepatoblast spesifikasyonlarına göre kesin endoderm ‘ye doğru astarlanıyorlardı. Bundan sonra, hepatoblastlar bir yıl23kadar kültürde muhafaza edilebilir 3D hepatospheres içine olgunlaştı. 3D küreler yapısını incelemek için, 30 gün-eski hESC-veya IPSC-türetilen küreler, hepatositler ve mezenkimal hücrelerde ifade edilen proteinlerin varlığını algılamak için sabit, kesitli ve lekelenmiş. Hepatosit nükleer faktör 4 Alfa (HNF4α) ve mezenkimal Marker vimentin, mezenkimal hücrelerin bir çekirdeğini çevreleyen hücreler gibi hepatosit oluşan bir dış tabakanın varlığını açığa, istihdam edildi (Şekil 2). Hepatositlerde ifade edilen proteinlerin ifadesini analiz eden bu deneyleri takip ettik: albumin, CYP3A ve E-cadherin. İmmünostik bu proteinlerin ifadesinin kürlerin dış katmanıyla sınırlı olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 3). Günde 30 kültürde hepatokürlerin fonksiyonel analizleri yapıldı. CYP1A2 ve CYP3A fonksiyonel hepatosit içinde önemli enzimler vardır. Aktivitelerini kurulan asder kullanılarak değerlendirildi. H9-türev hepatokürler 220.375 ± 74514 RLU/mL/mg proteininin CYP3A aktivitesini ve 732.440 ± 33.330 RLU/mL/mg proteininin CYP1A2 etkinliğini sergiledi (Şekil 4A). P106-türev hepatokürlerin CYP3A etkinliği 132117 ± 43.391 RLU/mL/mg protein ve CYP1A2 aktivite oldu 409.907 ± 121.723 RLU/mL/mg protein (Şekil 4B). İnsan primer hepatositlerin iki toplu ile karşılaştırıldığında, 3D karaciğer küreler CYP aktivite saygın seviyeleri gösteriliyor10. Albümin ve Alfa-fetoproteinin sentezini ve salgılanmasını analiz eden (AFP), sırasıyla H9-türevi hepatokürlerin 683,9 ± 84 ve 159 ± 20 ng/ml/24 h/mg-albümin ve alfa-fetoprotein proteininin (Şekil 5A) ortaya çıkarıldı. P106-türevi hepatospherler 497 ± 41 ve 756 ± 24 ng/ml/24 h/mg protein albümin ve alfa-fetoprotein, sırasıyla (Şekil 5B) sAlgılandı. Şekil 1 : Stepwise farklılaşma prosedürü hESCs 3D hepatospheres oluşturmak için. Mavi parantez, hiPSCs için farklılaşma günlerini temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2 : 3D hepatospheres yapısal yeniden yapılanma. Hepatosit nükleer faktör 4 Alfa (HNF4α-yeşil) ve vimentin (kırmızı) ifadesinin temsili görüntüleri (A) H9-türev 3D hepatospheres ve (B) P106-türeyen 3D hepatkürler ve onların karşılık gelen Immünoglobulin G (IgG) kontrolleri . Ölçek çubukları 60 μm temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3 : 3D hepatospheres içinde hepatik Marker Ifade değerlendirilmesi. Hepatosit belirteçlerinin ifadesinin temsili görüntüleri-albumin, CYP3A, E-cadherin ve onların ilgili IgG kontrolleri (A) H9-ve (B) P106-türevi 3D hepatkürler. Ölçek çubukları = 60 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 4 : 3D hepatospheres sitokrom P450 fonksiyonu. (A) H9-3D hepatospheres ve (B) P106-3D hepatospheres türetilen sitokrom P450 1A2 ve 3A aktivite ölçümü. Veriler, üç biyolojik çoğaltır ortalama temsil eder ve hata çubukları standart sapma (SD) gösterir. Etkinlik, mg protein başına mL başına bağıl ışık üniteleri (RLU) olarak alıntı yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 5 : Hepatosphere protein salgılanması analizi. Albümin ve Alfa-fetoproteinin (AFP) salgılanması (A) H9-türev 3D hepatospheres ve (B) P106-türevi 3D hepatospheres olarak incelendi. Veriler üç biyolojik çoğaltır temsilcisidir ve hata çubukları SD ‘yi temsil eder. salgılanmış protein, mg başına 24 h protein olarak nanogram protein olarak alıntı yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
3D olarak insan hepatospheres üretmek için tanımlanan ve Xeno-ücretsiz sistemlerin geliştirilmesi hem in vitro ve in vivo çaba için gereklidir. Günümüzde insan pluripotent kök hücrelerinden en çok hepatosit farklılaşma yaklaşımlarının iki boyutlu yapışan kültürlerde gerçekleştirildiği görülmektedir. Bu ortamlar dahil doku Genesis ve homeostazı dahil çevresel ipuçlarını birçok eksikliği; heterotypik hücre etkileşimleri, matris üretimi ve yeniden modelleme, in vivo biyoloji18,19kötü çeviri sonuçlanan.
Sonuç olarak, araştırma pluripotent kök hücrelerden hepatospheres üretmek için alternatif yaklaşımlar üzerinde duruldu. 3D çalışmalar bir dizi alan gelişmiş, ancak bu hayvan ürünleri20,22,24 destek sağlamak ve/veya insan dokusu kullanımı gerektirir21,22 karmaşıklaşan teknolojiyi ölçeklendirmek ve deneysel yeniden üretilebilirlik ve uygulama ödün.
Makalemiz içinde açıklanan prosedür (Şekil 1) tanımlanan, verimli, son derece tekrarlanabilir ve maliyet-etkili, fonksiyonel karaciğer küreler üretimini sağlayan, hangi bir yıl içinde vitro fonksiyonel kalır ve kritik karaciğer desteği sağlamak Vivo14. Önemlisi, bu platform Kullanıcı 3D karaciğer küreler boyutunu kontrol etmek için, yoğun nekrotik merkezleri ve fenotip kaybı oluşumunu kısıtlamaktadır sağlar.
3D hepatospheres Poly-HEMA kaplı plakaları için transfer Bu protokolde kritik bir adım temsil eder. Küre zarar görmesini önlemek için prosedürde bu aşamada yavaşça pipet önemlidir. Ayrıca, kesme stres ve küre yapısının bozulması önlemek için medya değişiklikleri dikkatle gerçekleştirilmesi gerekir.
Bu çalışmalarda, 3D hepatospheres organize bir yapı gösterilir (Şekil 2 ve Şekil 3), sitokrom P450 fonksiyonu (Şekil 4) ve salgılanmış karaciğer proteinleri, albümin ve alfa-fetoprotein dahil (Şekil 5). Bu prosedür, karşılaştırılabilir sonuçlar ile dört pluripotent kök hücre satırlarında başarıyla gerçekleştirildi. İleriye bakarak, bu teknoloji karmaşık mimarilerle daha fazla endodermal ve mezenkimal dokular geliştirmek için bir platform olarak istihdam edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada INGILTERE rejeneratif tıp platformu (MRC MR/L022974/1) ve baş bilim adamı ofisi (TCS/16/37) Ödülleri ile destekleniyordu.
Materials
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -. P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
Cite This Article
Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O’Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).